利用新型组织透明化技术对轻度脑外伤进行蛋白质组分析

niwanmao

组织透明化技术通过去除脂质和其他光散射成分，使组织变得透明，这样就能更好地观察和成像组织的内部结构，如细胞、血管和神经网络。组织透明化技术使研究人员能够更详细地研究组织和器官的三维结构，这对了解其功能和病理至关重要。此外，通过提高试剂和抗体对组织的穿透力，透明化技术还有助于对透明化组织进行分子水平的分析，如蛋白质组分析。

有几种类型的组织透明化技术用于生物学研究，包括：

1、基于有机溶剂的组织透明化技术（例如，3DISCO、uDISCO、vDISCO）：
- 优点：这些技术可快速高效地清除组织，允许对完整组织进行高分辨率成像和分析，保留了组织的结构完整性，能够对大样本进行深度成像。
- 缺点：基于有机溶剂的清除技术会引起蛋白质变性和丢失，导致蛋白质组的潜在变化。操作需要专门的设备和专业知识。

2、基于水凝胶的组织透明化技术（例如，CLARITY、PACT）：
- 优点：提供了极好的组织结构，能保留分子成分。去除脂质的同时保留蛋白质和核酸，能够进行进一步分子分析。
- 缺点：可能耗时较长，需要专门的试剂和设备。水凝胶基质可以限制抗体和其他分子的渗透，影响成像的深度。

3、水基组织透明化技术（如CUBIC、Scale）：
- 优点：兼容很多的荧光染料和抗体。保留良好的组织形态，可进行高分辨率成像。
- 缺点：与基于有机溶剂的方法相比，可能需要更长的清除时间，还可能导致组织膨胀，从而影响定量分析的准确性。

4、脂质组织透明化技术（例如，BABB、SeeDB）：
- 优点：相对简单，操作快速。提供了良好的组织透明度，允许对大样本进行成像。
- 缺点：可能导致组织收缩，可能不适用于所有类型的组织。还可能导致脂质损失和组织脂质组成的变化。


Bhatia HS等人在2022年12月份的Cell杂志上介绍了一种新型的组织透明化技术--vDISCO，利用荧光染料结合的纳米抗体稳定和增强内源性荧光蛋白的信号。他们还测试了这种方法在脑组织中的适用性，并发现可以在已存放了5年以上的福尔马林固定的人脑组织中进行蛋白质组学分析。结果显示，这种样品准备工作流程可以实现对清晰的小鼠和人类标本进行高深度和定量准确性的质谱分析。

作者使用vDISCO技术对小鼠脑组织进行了蛋白质组学分析，发现透明化过程对蛋白质组成没有明显影响，透明化后的蛋白质组与新鲜组织相似度高，重复性好。唯一受影响的是“血液微粒”（ blood microparticle）蛋白，这是因为新鲜组织未经灌注。透明化过程对膜、细胞器和细胞骨架等蛋白质组成的影响均在15%以下，膜相关蛋白质组成的变化不到3%，其中包括跨膜受体EGFR。

接着，作者还将vDISCO成功应用于轻微创伤性脑损伤（mTBI）小鼠模型（下图A），以识别和分析包含局部炎症的脑区蛋白质组，探索了技术在生物应用中的潜力。mTBI和脑震荡是常见的损伤，可能导致长期的病态，如睡眠障碍、神经精神障碍，甚至早期痴呆。通过vDISCO技术可发现在整个大脑的离散区域中存在微胶质细胞激活，尤其是沿着伸展的轴突束。同时，还证实了在相同的脑区域存在轴突异常。（下图B）



然后，在分离的 ROI 上使用DISCO-MS分析，与假手术对照组动物的相应区域相比，结果发现，mTBI 和对照组之间 ROI 的蛋白组中，有几种与轴突损伤和修复相关的蛋白在不同条件下受到强烈的差异调控，例如，stathmin1（Stmn1；增加32倍，一种参与微管丝系统调节的蛋白）、Neurocan（Ncan；增加30倍，一种硫酸软骨素蛋白多糖，参与调节细胞粘附和迁移），在损伤的大脑中上调（下图F），还有metadherin(Mtdh)等。此外，在 mTBI 模型中还有许多未知的蛋白被下调，例如酸性神经酰胺酶 (aCDase，Asah1)等。还观察到沿视觉束的线粒体蛋白的改变，如酪蛋白溶解蛋白酶蛋白水解亚基 (Clpp)和mitofusin 2(Mfn2)。最后，通过免疫荧光进一步验证了 mTBI 脑组织中 Stmn1 和 Ncan 的富集（下图G）。这些数据表明，DISCO-MS是获得已知空间位置的异质性组织区域无偏倚蛋白质组信息的有力方法。



vDISCO 技术可对组织透明化的大脑样本进行高分辨率成像和蛋白质组分析，为了解与 mTBI 相关的分子变化提供了宝贵的信息，在研究神经系统疾病方面有较大的潜力，为在蛋白质组水平上研究大脑病理提供了一种新方法。

参考文献：Bhatia HS, Brunner AD, Öztürk F, et al. Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens. Cell. 2022;185(26):5040-5058.e19. doi:10.1016/j.cell.2022.11.021