遗传毒性检测再升级： 使用成像流式细胞仪进行多参数微核试验

niwanmao

遗传毒性检测对于评估化合物造成 DNA 损伤的可能性至关重要，而 DNA 损伤是癌症发展的一个关键因素。目前的体外遗传毒理学筛选试验在早期药物开发中发挥着至关重要的作用，有助于识别具有低遗传毒性潜力的候选药物。然而，这些试验往往会产生大量误导性阳性结果，导致不必要的动物试验或放弃具有潜在价值的候选药物。

了解化学品的作用模式（MoA）对于准确确定其真正的遗传毒性潜力和评估临床使用风险至关重要。为了应对这一挑战，Harte 等人利用成像流式细胞仪开发了一种新型多参数微核试验。这种方法将流式细胞仪的高通量能力与成像流式提供的空间和形态信息相结合，为遗传毒性评估提供了一种更全面、更高效的方法。


材料与方法
细胞培养和处理
研究使用了具有p53功能的人淋巴母细胞系TK6细胞，在标准条件下进行培养。为了展示实验能够区分克隆基因毒性和非克隆基因毒性的作用机制，细胞被处理以工具化合物甲基苯并咪唑（一种aneugen）和甲基磺酸甲酯（MMS，一种clastogen）。

流式细胞术样品制备
处理后，细胞被收获并使用标准化方法进行固定。固定后的细胞被用γH2AX、p53和pH3S28的抗体以及DRAQ5™进行染色，用于DNA染色。这一染色程序经过优化，允许通过成像流式细胞术分析未裂解的细胞。

成像流式细胞术
系统设置为在多个荧光通道捕获图像，包括：
1. DRAQ5™用于DNA含量（核染色）
2. AlexaFluor 488用于pH3S28检测
3. 藻红蛋白（PE）用于p53检测
4. AlexaFluor 647用于γH2AX检测

仪器设置为每分钟捕获约7000个细胞图像，为分析提供了大量数据。

1、微核检测：
- 应用了基于大小、形状和相对于主核位置的一系列图像掩模，以隔离潜在的微核。
- 使用“斑点计数”功能对每个细胞中的微核进行计数。

2、细胞周期分析：
- 通过DRAQ5™荧光强度分析DNA含量，将细胞设门分为G1、S和G2/M期。

3、生物标志物定量：
- 对每个生物标志物（γH2AX、p53、pH3），利用未染色和染色对照样本建立强度阈值。
- 根据这些阈值以上的荧光强度定义阳性细胞群。

4、模板批量处理：
- 创建了一个模板，用于自动处理多个数据文件，从而实现对剂量-反应关系的高通量分析。

5、自动化评分验证
- 为了评估自动化微核检测的准确性，从四个不同的原始图像文件中手动计数了约4000个细胞，并将结果与自动化结果进行比较。

结果
微核检测
该文开发了一种复杂的掩模策略，用于自动检测和量化TK6细胞中的微核事件。这一策略包括以下步骤：
1. 通过强度阈值设定识别DRAQ5染色区域（细胞核和潜在的微核）。
2. 应用"Spot"掩模功能隔离明亮的斑点。
3. 根据形状完整度和大小标准过滤斑点。
4. 使用"Level Set"和"Range"功能隔离主要的细胞核。
5. 通过减去母核掩模确保微核位于主核之外。

这一过程重复三次，使用不同的大小和形状完整度设置以提高敏感度。最终的"Complete Final MN Mask"（CFM）通过与细胞质掩模结合生成。

与手动计数相比，自动微核检测的平均准确率为57%（范围35-72%），漏检率为44%（范围3-73%），这显示了自动化方法的潜力和局限性。

细胞周期和多参数分析
这篇文章有意思的地方是，可以同时将细胞分类到不同的细胞周期阶段并量化DNA损伤生物标志物的表达：
1、细胞周期设门：
- 通过DRAQ5的强度识别G1、S和G2/M期细胞群。

2、生物标志物定量（γH2AX、pH3、p53）：
- 使用未染色样本确定背景自发荧光水平。
- 结合未染色和染色样本数据定义阳性细胞群。

3、p53设门：
- p53阳性的细胞进一步分为p53+（背景水平）和p53++（诱导水平）群体。

4、pH3设门：
- 识别pH3阳性的细胞，并与DNA含量相关联以评估有丝分裂细胞群。

5、γH2AX设门：
- 定量γH2AX阳性的细胞，并分析其与细胞周期位置的关系。

下图显示的是γH2AX表达群体的设门策略。i图相对于不表达γH2AX的细胞（主要峰），+BV421（γH2AX）和++BV421（γH2AX）位于次要峰上。这些设门的位置是根据暴露于或未暴露于致裂剂的样本来确定的，以区分背景γH2AX表达和由致裂剂诱导的DNA损伤。j图用于γH2AX评估的最终设门。k图将γH2AX++设门的群体进一步细化，以反映位于核内的γH2AX事件，通过形态相似性特征得到'真正的核结合γH2AX'群体。


概念验证结果
研究者通过两种工具化合物展示了多参数方法区分化学物诱导微核不同机制的实用性：
1、甲基苯并咪唑：
- 显示出与剂量相关的微核形成增加。
- pH3阳性细胞显著增多，表明其致畸机制。
- γH2AX的诱导作用微弱，与其非致裂性质一致。

2、甲基磺酸甲酯（MMS）：
- 显示出与剂量相关的微核形成增加。
- γH2AX的强烈诱导，反映出其DNA损伤特性。
- pH3水平影响较小，与其非致畸机制一致。


表：aneugen和clastogen两类化合物不同机制的多参数对比
| 标记物 | 甲基苯并咪唑 (Aneugen) | MMS (Clastogen) |
|-----------|------------------------|------------------|
| Micronuclei | ↑↑ | ↑↑ |
| pH3 | ↑↑↑ | − |
| γH2AX | − | ↑↑↑ |
| p53 | ↑ | ↑↑ |

本研究开发的多生物标志物方法提供了对遗传毒性的全面评估，使得同时评估微核形成、DNA损伤响应和细胞周期干扰成为可能。通过结合这些终点，为测试化合物的遗传毒性潜力提供了更深入的机制理解，有可能减少遗传毒性筛选中假阳性结果的出现。

尽管自动微核检测在准确性和漏检率方面与手动计数相比存在一些局限性，但为进一步改进提供了起点。未来机器学习和图像分析算法的发展有可能提高自动评分的准确性，使这种方法更加强大和可靠。

参考文献：Harte, D.S.G., Lynch, A.M., Verma, J. et al. A multi-biomarker micronucleus assay using imaging flow cytometry. Arch Toxicol (2024). https://doi.org/10.1007/s00204-024-03801-7