绝对计数

日月星辰

niwanmao 发表于 2012-7-10 21:34

                               
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白色是同型对照，但不是说阳性区域绝对一点白色都不会有，因为同型对照的表达率一般不可能是0％的，因为 ...

好的，我下次把FSC调低一点~有高手指导心里踏实多了，自己做完全摸不着头脑啊
1.其实还有一个很弱的问题，就是荧光微球究竟是什么原理？网上查到的只是关于它的简单介绍和使用
我购买的是spherotech公司的微球，说明书上说总标记有三种荧光（PE/FITC/PE-CY5），我的实验只用了一种抗体，是PE标记的。微球是怎么和细胞作用的呢，是只吸附阳性细胞吗？是通过抗体上的PE连接到微球的么？
2. 微球用于绝对计数的作用是什么呢？查的资料上说，荧光微球用来作为内参，还是不太明白....
3. 微球上有三种荧光，而我的抗体只有一种荧光，这样，微球上剩下的两种荧光是不是就浪费啦，有没有别的用处呀？

日月星辰

niwanmao 发表于 2012-7-10 21:32

                               
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1、是的，细胞种类不同，可能由于其胞内颗粒度不同，会导致荧光强度不同，从而形成多个峰。不知道检测时 ...

在计算结果的时候，比如同型对照P3是30，样本的P3是80，
在用公式计算时，P3需要80减去30吗，还是直接用80计算？

niwanmao

日月星辰 发表于 2012-7-10 23:26

                               
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好的，我下次把FSC调低一点~有高手指导心里踏实多了，自己做完全摸不着头脑啊
1.其实还有一个很弱的问题 ...

1、荧光微球其实就是一种带荧光标记的小球（你可以把它想象成已经标记上荧光的细胞），只不过它的密度、总数等都已经知道了，所以，可以根据我们的样本与它的比例，来进行样本细胞的绝对定量。
微球不会与细胞结合的，它是作为独立的信号存在，这样才能进行作为参照物，按照公式进行计算啊。

2、所谓的内参应该就是指计数的参照物，举个例子，在1ml PBS重悬的标本中，细胞数未知，我们加入了5000个微球（假设为50ul），最后检测出来，按照软件分析，细胞与微球的比例为10：1，那么我们就可以根据已知的微球数，得出前面这1ml悬液中有50000个细胞。当然我这里举的数字是假的，但计算步骤是一样的。

3、该公司卖的这三种荧光不是同时用的，是让你选择一种，可以跟你的样本标记的荧光相搭配，不冲突。例如你的样本标记了FITC荧光，那么你就得选择PE或者PE-CY5的荧光，以避免与你的样本相冲突。

niwanmao

日月星辰 发表于 2012-7-10 23:34

                               
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在计算结果的时候，比如同型对照P3是30，样本的P3是80，
在用公式计算时，P3需要80减去30吗，还是直接用8 ...

应该直接用80

日月星辰

niwanmao 发表于 2012-7-11 09:20

                               
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1、荧光微球其实就是一种带荧光标记的小球（你可以把它想象成已经标记上荧光的细胞），只不过它的密度、 ...

哦，原来是这样的，总算是明白了，多谢~嘿嘿

niwanmao

日月星辰 发表于 2012-7-11 22:52

                               
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哦，原来是这样的，总算是明白了，多谢~嘿嘿

不客气。有什么情况继续讨论：）

日月星辰

niwanmao 发表于 2012-7-12 08:41

                               
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不客气。有什么情况继续讨论：）

好滴，嘿嘿

特别懒的小豹子

niwanmao 发表于 2012-7-12 08:41
不客气。有什么情况继续讨论：）

请教老师，体外实验比如趋化实验绝对计数，流式染色和加微球应该同步吗，看到试剂说明和protocol文献不一样，试剂说明是上机前加微球，文献是同时流式抗体和微球，这样同洗同丢

niwanmao

特别懒的小豹子 发表于 2022-1-3 12:34
请教老师，体外实验比如趋化实验绝对计数，流式染色和加微球应该同步吗，看到试剂说明和protocol文献不一 ...

一般绝对计数，大多是免洗为主。
真避免不了洗涤，我个人倾向于上机前加，因为这样至少可保证微球数是准确的（不过瓶装的微球，经过多次使用之后，本身也是容易不准的，尽可能用绝对计数管最好）。

特别懒的小豹子

niwanmao 发表于 2022-1-3 14:15
一般绝对计数，大多是免洗为主。
真避免不了洗涤，我个人倾向于上机前加，因为这样至少可保证微球数是准 ...

谢谢老师回复，我再确定下，如果使用瓶装的微球，说明书上写这个微球 are excited by a variety of lasers including violet (405nm), blue (488nm), yellow/green (562nm), and red (633nm)，那我的细胞流式染色是不是会受上面影响（加入需要染5-8个marker），最好是用来绝对计数的样本和检测基本亚群比例的管分开测？还是说因为微球荧光特别强，所以不影响对细胞的圈门，可以在同一管样本，既检测微球又检测细胞的分群？