胞内细胞因子检测问题

woodking

BD的盒子里是两瓶的
Kit components:
• Fixation/Permeabilization solution (125 ml)
• BD Perm/Wash™ buffer,

那个加粗的只是标题啊，下面的1,2,3,4里没有加破膜剂的步骤，只写了个加perm/wash buffer的

woodking

foxp3是要破核膜的，好像是更强的一点的，有两步。

woodking

倪老师，还想请教一下，空白对照的基础荧光阈值高了是怎么回事呢？

niwanmao

woodking 发表于 2013-1-25 22:01

                               
登录/注册后可看大图

BD的盒子里是两瓶的
Kit components:
• Fixation/Permeabilization solution (125 ml)

可能叫法不同吧，我觉得应该是第二个加粗的部分Perm/Wash™ Buffer。
关于foxP3核内标记，它和胞内的标记一样都是两步，但它的第二步要复杂一些，破膜剂组成也不同。

woodking

可那只是个10×的buffer呀，真正起破膜作用的是那个Fixation/Permeabilization solution。

倪老师，空白对照的基础荧光太高该怎么办？老师说洗的不够，我很困惑，这里面啥抗体都没加，再洗有用吗？

niwanmao

woodking 发表于 2013-1-25 22:11

                               
登录/注册后可看大图

可那只是个10×的buffer呀，真正起破膜作用的是那个Fixation/Permeabilization solution。

倪老师，空白对 ...

空白对照的荧光太高有可能跟你细胞状态或细胞本身有关，空白对照我觉得没有必要设置吧。象你如果要做CD4、CD3、IL-17，那么就直接用CD4、CD3这个FMO对照（即扣掉一个荧光参数）来设置IL-17的maker。

niwanmao

woodking 发表于 2013-1-25 22:11

                               
登录/注册后可看大图

可那只是个10×的buffer呀，真正起破膜作用的是那个Fixation/Permeabilization solution。

倪老师，空白对 ...

Fixation/Permeabilization solution是什么成份查不到，可能有一定的破膜成份，但看了Perm/Wash Buffer的说明书之后（BD Perm/Wash buffer consists of 100 ml of concentrated stock solution (10X) containing both Fetal Bovine Serum (FBS) and saponin）真正起破膜作用的我认为是它，因为其中的皂素就是最经典的破膜成份。
http://www.bdbiosciences.com/ext ... d/2091KZ_554723.pdf

woodking

那放在这个buffer里过夜的话，破膜的时间是不是太长了啊？

niwanmao

woodking 发表于 2013-01-25 22:36:13

                               
登录/注册后可看大图

那放在这个buffer里过夜的话，破膜的时间是不是太长了啊？

所以我前面说的是用第一个组分，固定过夜

woodking

bd的说明书上是如果要间隔一段时间再染色的话用4%多聚甲醛4度10-20分钟，staining buffer洗涤两次后，用staining buffer重悬保存。