教你一招：如何设置实验中的对照？

椴树

老师你好 我想问下多色的FMO设置 我没看懂
1：比如说我染了PE和PE-Cy5的样品，上机后，我需要调节的是什么呢？FITC和PE染的样品调节的又是什么呢？还有FITC和PE-Cy5呢？
2： 我用的BD的FITC，PE和APC三色，FITC和PE一个激发光，跟APC不同，我做荧光补偿只做单染FITC和PE的，为什么有人说不够呢？我这个还要做FMO么？ 我不太懂用FMO设置的是什么门？
3：还有以前听一个技术支持说过，我用FITC和PE，如果有同型对照的话，就不用设置荧光补偿了，是这样的么？

niwanmao

椴树 发表于 2013-5-12 17:36

                               
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老师你好 我想问下多色的FMO设置 我没看懂
1：比如说我染了PE和PE-Cy5的样品，上机后，我需要调节的是什么 ...

1、FMO主要功能是用来设置分析是MARKER位置，例如你这里举例的3色方案，PE和PE-CY5的FMO是用来设置分析时FITC通道的MAKER，FITC和PE的FMO设置的PE-CY5的marker位置，简而言之，就是设置荧光素缺失那个通道的MAKER位置。
2、对于荧光补偿，只做FITC和PE单染是可以的，但是FMO建议还是都做一下，如第一条所言，FMO主要功能是设置MARKER位置，因为FMO把你要分析的荧光素去掉，其它条件与你检测样本完全一样，所以这时设置的MARKER位置是最准确的。
3、错。原因同第2点。

willow2013

niwanmao 发表于 2013-5-12 20:55
1、FMO主要功能是用来设置分析是MARKER位置，例如你这里举例的3色方案，PE和PE-CY5的FMO是用来设置分析时 ...

倪老师，看见你上边的3色方案设计，想问下，我是测间充质细胞表面抗原，鉴定它是否是间充质细胞，CD73-PE，CD105-APC，CD44-PE，CD146-FITC，我是否要从1-7号管做？如果我每支管一种抗体来做是否可以，就是四种直标抗体，每种放入一个流式管，三种同型对照，每种一支流式管，外加一个空白对照，这样是否可行呢？

niwanmao

willow2013 发表于 2014-2-21 12:23
倪老师，看见你上边的3色方案设计，想问下，我是测间充质细胞表面抗原，鉴定它是否是间充质细胞，CD73-PE ...

你这4种标记是不是都要分析其表达率？

willow2013

niwanmao 发表于 2014-2-21 14:01
你这4种标记是不是都要分析其表达率？

恩，是的

willow2013

niwanmao 发表于 2014-2-21 14:01
你这4种标记是不是都要分析其表达率？

如果要分析表达率，像我那样每种直标抗体一支流式管检测，是否可以呢？或者会存在哪些问题那？
谢谢

niwanmao

willow2013 发表于 2014-2-24 10:17
如果要分析表达率，像我那样每种直标抗体一支流式管检测，是否可以呢？或者会存在哪些问题那？
谢谢 ...

我个人觉得这样比较好：
1管——3种同型对照（调节电压）
2管——CD73-PE+CD105APC+同型-FITC
3管——CD73-PE+CD146-FITC+同型-APC
4管——CD146-FITC+CD105APC+同型-PE
5管——CD73-PE+CD105APC+CD146-FITC（检测管）


2、3、4除了可调节补偿之后，同时也分别作为FITC、PE、APC的marker设置参考。

willow2013

niwanmao 发表于 2014-2-24 13:14
我个人觉得这样比较好：
1管——3种同型对照（调节电压）
2管——CD73-PE+CD105APC+同型-FITC

还有一个CD45-PE啊，直接单染在第六管，可以吗

niwanmao

willow2013 发表于 2014-2-24 16:26
还有一个CD45-PE啊，直接单染在第六管，可以吗

如果其同型一样，这几管就够了，如果CD45的同型与CD73的同型不是一个来源，那么建议再做第6管，搭配同第4管，只不过换成了CD45的同型。
如果觉得抗体比较浪费，可以取消第3管，因为FITC、PE对APC一般没有干扰。

willow2013

niwanmao 发表于 2014-2-24 19:45
如果其同型一样，这几管就够了，如果CD45的同型与CD73的同型不是一个来源，那么建议再做第6管，搭配同第4 ...

谢谢倪老师！
CD45-PE的同型对照与CD73-PE是相同的，我要做的目的是检测这4种直标抗原在细胞表面的表达，您给我的设计只有3个直标抗原，第四个也就是CD45-PE没有用上，所以我想知道CD45-PE要怎么检测？
呵呵！我要准备制备样品，拿去请别人检测，所以希望弄清楚了，之后我好染色！麻烦您了