FITC单染补偿？火箭峰是什么？

haven_t · 发表于 2013-5-9 11:04:38

samly0 发表于 2013-5-9 09:25

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我觉得第一张虽然是空白，什么都不加，但也不能完全代表细胞自然状态，因为贴壁细胞，不管是消化下来或者用 ...

我所说的自然状态是指没有任何外界荧光染料下的状态。
我没有否定样品中存在死亡的细胞，如果仅仅用死亡细胞是无法解释的。为什么机械损伤造成状态差或死亡的细胞，在没有任何荧光标记的情况下出现这种火箭样的图形呢？
如果是因为状态差或死亡，在不加任何荧光标记的情况下都能引起图形有这么明显的改变那么PI和7-AAD就不用加了，直接上空白，通过图形改变即可判断有多少细胞死亡。

haven_t · 发表于 2013-5-9 11:10:59

本帖最后由 haven_t 于 2013-5-9 11:12 编辑

ddn111 发表于 2013-5-9 10:10

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１、做凋亡中的空白细胞其实没多大用处，还是要用ＦＭＯ，也就是单染做对照！蛋白标记上荧光后和荧光抗体标 ...

同意您的观点，但是补偿是否调到位就很难说了，如果结合空白的图形来看，FITC单染后PI荧光强度基本和空白持平，如果补偿不足，FITC强度增加PI通道肯定比空白高，我个人认为单染图形的箭头仅仅是空白图形的往右平移，从荧光强度值的对比应该没有很大问题。

ddn111 · 发表于 2013-5-9 11:17:21

关于空白群有时出现斜向上的现象我对楼上的分析比较认同，碎片引起的火箭峰是另一回事。
现在疑惑的是，荧光标记后的细胞和空白细胞相比，本底信号出现荧光强度增大的现象怎样解释？特别是像凋亡检测中，荧光标记非抗体蛋白中常见！但用荧光标记无关蛋白ＢＳＡ加入细胞的话，本底基本不变。
荧光标记蛋白纯化不良？
游离荧光素？

niwanmao · 发表于 2013-5-9 11:33:41

haven_t 发表于 2013-5-9 11:04

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我所说的自然状态是指没有任何外界荧光染料下的状态。
我没有否定样品中存在死亡的细胞，如果仅仅用死亡 ...

这样的讨论非常好。

确实，象这种没染任何染料就出现的非特异性自发荧光多数都是由于NADPH或黄素蛋白引起，488nm激发，但是细胞经过物理或化学处理、细胞老化等状态都会导致这些自发荧光增高，原因不详，估计总是跟这些胞膜或胞内成份改变有关吧。

niwanmao · 发表于 2013-5-9 11:38:23

ddn111 发表于 2013-5-9 11:17

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关于空白群有时出现斜向上的现象我对楼上的分析比较认同，碎片引起的火箭峰是另一回事。
现在疑惑的是，荧 ...

似乎也只能这样解释了 @samly0 @haven_t

椴树 · 发表于 2013-5-9 14:45:06

ddn111 发表于 2013-5-9 10:10

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１、做凋亡中的空白细胞其实没多大用处，还是要用ＦＭＯ，也就是单染做对照！蛋白标记上荧光后和荧光抗体标 ...

谢谢可是补偿值都调节到29了，为什么用不含钙的binding buffer洗呢 FITC没有分开是因为染的不好么

椴树 · 发表于 2013-5-9 14:47:14

samly0 发表于 2013-5-9 09:25

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我觉得第一张虽然是空白，什么都不加，但也不能完全代表细胞自然状态，因为贴壁细胞，不管是消化下来或者用 ...

恩它就是拿来设门调电压的吧阴性对照反应了非后期药物处理导致的细胞状态吧

椴树 · 发表于 2013-5-9 14:52:03

haven_t 发表于 2013-5-7 23:07

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可能对于非特异性染色的概念大家都不一样，我个人觉得成为非特异荧光可能恰当一点，因为blank里面也会出 ...

谢谢我消化下

椴树 · 发表于 2013-5-9 15:27:20

haven_t 发表于 2013-5-9 11:10

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同意您的观点，但是补偿是否调到位就很难说了，如果结合空白的图形来看，FITC单染后PI荧光强度基本和空白 ...

谢谢，你讲的我不太明白，“FITC单染后PI荧光强度基本和空白持平”这是怎么看出来的啊，FITC单染后不是只有LL和LR象限有细胞么，PI阳性的没有啊，空白指的是不加染料的第一组么？那组只有LL象限有细胞啊？
“从荧光强度的对比应该没有很大问题”指的是补偿调节没有很大问题么？怎么看荧光强度的对比呢？
正常情况下的不染色细胞是不是应该成一团，而不是像我这样，我之前好几次都是这样在对角线上，翻了以前单染膜蛋白的发现不染色细胞也是这样在对角线上。
谢谢我看了一些流式的原理但是实战经验很少好多都不懂谢谢前辈们指教

椴树 · 发表于 2013-5-9 15:31:16

ddn111 发表于 2013-5-9 11:17

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关于空白群有时出现斜向上的现象我对楼上的分析比较认同，碎片引起的火箭峰是另一回事。
现在疑惑的是，荧 ...

谢谢你指的本底信号是哪些？从哪里看呢？

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[结构和原理] FITC单染补偿？火箭峰是什么？