磁珠分选有没有特别的注意事项？

samly0

niwanmao 发表于 2013-6-8 16:44

                               
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@samly0   按照你的经验，流式的分选纯度高还是磁珠的分选纯度高？

其实都是用抗原跟特异性的抗体结合的原理来分选细胞，只是一个用磁珠拉，一个用流式机子拉，排除机器和人为误差后，我觉得两个的纯度应该是差不多，但是用哪个好还是看课题需要的吧。磁珠分选的特点是：设备要求简单，比较便宜，一套设备大概1w左右吧，还不容易坏，不需要维护成本，便携轻便。可以在超净台操作，不容易污染，阳选纯度高。得率看样本阳性分子的表达高低，同样数量的细胞悬液，分选CD25阳性分子得率就要比CD4阳性分子得率低，所以想提高表达低的分子的得率，用于磁珠分选的细胞悬液就要准备更多，分选的时间更长。阴选通常用的是混合抗体，这点就很限制其纯度，纯度高低跟混合抗体能去除的Maker有关，而且用于阴选磁珠抗体可选的范围比阳选磁珠抗体少，很限制其使用的范围，流式分选就没有这个限制。流式分选的特点是：对场地和设备要求高，我们这边机子的开机费就要200块，分选时再按每小时200块计算，不算抗体的成本，而且比较容易污染，活性也没磁珠分选好，但是可以同时分选很多阳性指标，这是磁珠分选没法做到的。我们这边流式分选的机子是专职老师操作的，我没机会操作，所以对机器使用没有什么经验啊。

liaoyanchun

samly0 发表于 2013-5-21 15:53

                               
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想提高纯度，还是换新柱子再过一遍吧。我们为了提高得率，通常都不换柱子，而且分选完上流式看纯度也能达 ...

冲打的时候一次加多少buffer

liaoyanchun

samly0 发表于 2013-5-21 15:53

                               
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想提高纯度，还是换新柱子再过一遍吧。我们为了提高得率，通常都不换柱子，而且分选完上流式看纯度也能达 ...

活塞打的时候加多少buffer

samly0

我一般用500ul

木石织梦

samly0 发表于 2013-7-5 15:46

                               
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我一般用500ul

再请教samly0老师，养选后，上流式检测前不再染相应抗体会不会有影响？比如荧光会部分淬灭之类的？

samly0

木石织梦 发表于 2013-7-16 23:44

                               
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再请教samly0老师，养选后，上流式检测前不再染相应抗体会不会有影响？比如荧光会部分淬灭之类的？ ...

不会淬灭的，你的磁珠分选抗体是自带荧光的么？不是的话，要自己另外标记哦。我原来做的CD25磁珠抗体本身是标有PE的，我自己又加标了个CD4-FITC，然后才上机检测。

liliqianyi

samly0 发表于 2013-7-18 11:00

                               
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不会淬灭的，你的磁珠分选抗体是自带荧光的么？不是的话，要自己另外标记哦。我原来做的CD25磁珠抗体本身 ...

@samly0 老师您好！
我最近也是在做treg的磁珠分选，用的美天旎的Regulatory T cell isolation kit，miniMACS 分选器。
可是的分选的纯度一直不稳定，有的时候90%，有时只有60%，想问一下你们是完全按照说明书的量加的吗，似乎完全按照说明书的量加，挺贵的。

还有不知道你们分选出来的细胞有没有进行扩增培养，我的细胞用的CD3/CD28磁珠扩增的效果也不太好。
希望您多多指教！！

samly0

liliqianyi 发表于 2013-11-4 17:42

                               
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@samly0 老师您好！
我最近也是在做treg的磁珠分选，用的美天旎的Regulatory T cell isolation kit，miniM ...

我刚开始完全按说明书量加，分选纯度稳定了，再开始减量，做过1/2和1/4量，最后用1/4量做的，这个量的多少跟你一次待分离的单个核细胞或者淋巴细胞的数量有关，我每次用10^7分选时用1/4量的，还是那句话，不同实验室的条件和不同人操作的过程不同，仅供参考，实验也是熟能生巧的，多做几次，结果就稳定了

liliqianyi

samly0 发表于 2013-11-14 09:30

                               
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我刚开始完全按说明书量加，分选纯度稳定了，再开始减量，做过1/2和1/4量，最后用1/4量做的，这个量的多 ...

嗯，谢谢您的回复。
追问一句，比如按您说的，抗体减少后的量是整体都减少为原来的1/4吗？我之前摸的，会把阴性分选的抗体（biotin-antibody cocktail，anti-biotin-beads）多加一些，阳性分选（CD25-PE，anti-PE beads）少加一些。

还有，不知道您是否会把分选后的细胞继续培养，我按文献的培养体系（CD3/CD28beads，il-2），细胞一直没有扩增。
还请您多多指教！！

samly0

不是整体减少的，根据抗原表达强弱减，比如说分选CD4+这种表达高的，就多加点抗体，分选CD25+这种表达少的就少加一点