为什么我的样品不固定就染不上？

niwanmao · 发表于 2013-7-31 07:23:11

resurgam 发表于 2013-7-31 02:56

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那我就悲剧了，老板是明确表明不让买同型对照的，ta觉得没有必要。老板让我这4个做出来了，就再试试其他7 ...

如果用PFA固定，影响还是比较大的。
我们一般是这么做的：
如果这个标记表达呈明确的阴性、阳性双峰分布，那么可以不用同型或FMO（例如CD4、CD8、CD3的检测）。
如果这个标记呈弱表达，表达强度跨越阳性、阴性之间，那么必须要用同型或FMO，否则如何确定阴性、阳性分界？你说是吧。

didi_zhou · 发表于 2013-7-31 12:43:10

测膜表面抗原使用FPA固定不好，会造成非特异性染色。说说你要做的抗原是什么。

resurgam · 发表于 2013-8-1 01:41:40

niwanmao 发表于 2013-7-31 07:23

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如果用PFA固定，影响还是比较大的。
我们一般是这么做的：
如果这个标记表达呈明确的阴性、阳性双峰分布 ...

唉，表达确实很弱，而且也没有明确的阴性阳性双峰，看起来就是一个宽了一点的单峰。今天又去老板哪里磨叽了一下，好歹是让我去查查其中一个蛋白的国产同型对照的价格再说。非常感谢您的指导，学习了很多的东西。谢谢！

resurgam · 发表于 2013-8-1 01:47:09

本帖最后由 resurgam 于 2013-8-1 01:51 编辑

didi_zhou 发表于 2013-7-31 12:43

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测膜表面抗原使用FPA固定不好，会造成非特异性染色。说说你要做的抗原是什么。 ...

您好，我老板今天同意让我查其中一个表面蛋白的同型对照的国产商品价格，是TIM-3，想检测其在RAW264.7表面的表达情况，但是一直都染不上，由于之前老板不让买同型对照，所以我一直拿完全不染的细胞做阴性，但是还是没有阳性群。但是用PFA固定后就突然染上了，重复做了几次，也试过了在室温染30分钟，结果都是不加PFA的就染不上，加了的就染上了。个人觉得不太对，所以就上论坛来求助了。新手，接触流式不满一个月的时间，所以很多都不懂。谢谢大家的指导和帮助。

niwanmao · 发表于 2013-8-1 07:56:05

resurgam 发表于 2013-8-1 01:47

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您好，我老板今天同意让我查其中一个表面蛋白的同型对照的国产商品价格，是TIM-3，想检测其在RAW264.7表面 ...

一般情况下，买同一厂家的推荐同型对照最好。
TIM-3的表达在一般情况下是表达很弱的，但是慢性病毒感染可能会出现增强。下面这篇文章供您参考。这里想问一下，你做TIM-3的时候，有没有同时做CD4或CD8并用这两个标记设门？

Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection.pdf (806.48 KB, 下载次数: 8)

boiledtea · 发表于 2013-8-1 21:04:13

楼主能不能上个图？我想看看你用PFA固定后的细胞的阳性是什么样子的。。

resurgam · 发表于 2013-8-2 21:46:59

niwanmao 发表于 2013-8-1 07:56

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一般情况下，买同一厂家的推荐同型对照最好。
TIM-3的表达在一般情况下是表达很弱的，但是慢性病毒感染可 ...

老板让我检测的是鼠巨噬细胞表面的TIM-3的表达。唉，终于是给我买了个同型对照，虽然是国产的，但总比没有要好。谢谢对我的指导和帮助。

resurgam · 发表于 2013-8-2 22:05:12

本帖最后由 resurgam 于 2013-8-2 22:06 编辑

resurgam 发表于 2013-8-2 21:46

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老板让我检测的是鼠巨噬细胞表面的TIM-3的表达。唉，终于是给我买了个同型对照，虽然是国产的，但总比没 ...

依照建议，未固定的试了试室温染20min的，由于没有同型对照，用全阴性的划门。结果不固定室温染20min效果也不好（图2），但固定了效果4度染也还行（图1），放的是重新做的结果。觉得用PFA固定了整个群向右偏，不太对。

niwanmao · 发表于 2013-8-2 22:36:04

resurgam 发表于 2013-8-2 22:05

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依照建议，未固定的试了试室温染20min的，由于没有同型对照，用全阴性的划门。结果不固定室温染20min效果 ...

就一个荧光标记么？如果有其它的标记，能不能把FSC/SSC点图、其它荧光各个组合的散点图一起放上来。或者直接放两个原始数据文件上来。

didi_zhou · 发表于 2013-8-4 22:12:14

niwanmao 发表于 2013-7-27 22:33:36

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刘星宇发表于 2013-7-30 19:50
孵抗体后固定，抗原表达下降（荧光淬灭）可以理解，但不明白为啥会增多呢？ ...
不是的，固定后不是荧光淬灭，而是由于自发荧光导致荧光强...

图2结果不错啊，有明显的阳性群啊，只是比较弱。不过门不该这么画，结果发来帮你画门。

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