凋亡检测问题

niwanmao

samly0 发表于 2013-8-14 17:54

                               
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倪老师，我重新分析了一下，不设FS/SS，分析全部细胞，结果还是那么纠结呢
...

好像都是36小时出问题。就象@didi_zhou  所说，可能你反向加药这种方式，细胞的批次差异还是太明显，所以造成结果不稳定。
如果是同一批细胞按不同时间取样估计不会造成这种情况吧。
不过你们那边条件所限，也没办法。

samly0

niwanmao 发表于 2013-8-14 19:14

                               
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好像都是36小时出问题。就象@didi_zhou  所说，可能你反向加药这种方式，细胞的批次差异还是太明显，所以 ...

是呀，这边没有哪个单位的流式仪肯在下班时间开放的，都是按行政班开放，哎~

pushiming77

师姐，你已经做的很好了。你看到我周围的人做的，想死的心都有。36小时的时候是不是前向—侧向的圈门有问题，漏掉了一些死细胞。不可能死细胞后比较48小时还要少。具我这儿的教训，Buffer的正确稀释与否对前-侧向角的影响是很大的。

samly0

pushiming77 发表于 2013-8-18 15:20
师姐，你已经做的很好了。你看到我周围的人做的，想死的心都有。36小时的时候是不是前向—侧向的圈门有问题 ...

我第二次放上的图就是不圈门的，应该不会漏掉死细胞了，但结果还是一样的，所以我觉得圈门应该不是问题，而是实验设计问题，我还是要想办法做次正向加药看看会不会是这个原因。buffer是按说明书方法把试剂盒配的10xbuffer按1:9体积用双蒸水稀释成1x的用，那下次我再重新配一管试试，谢谢你的建议哈。

pushiming77

我也是我这儿检测时的一点教训

椴树

samly0 发表于 2013-8-9 11:49

                               
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可不可以认为这种淋巴瘤的细胞增殖周期是24小时，而对药物最敏感的时间段在24h、48h？那我把12h也做上看看 ...

我上次做的高渗处理测凋亡，时间太久反而凋亡率下降，在收集细胞的过程中，我发现靠后的时间点或者更高浓度处理组的细胞数量要少很多，我开始是同样的细胞量处理的，不同时间刺激，同一时间收样，我觉得太剧烈的凋亡刺激因素导致细胞通透性变化太大，一些凋亡和坏死的细胞在离心过程中丢失了，不晓得对不对，我当时是这么理解的，而且从我的FSC和SSC的图上来看，剧烈的刺激使得细胞均一性变差，细胞分布比对照组散很多。为什么你的对照组不同时间点的凋亡率差别这么多啊？

samly0

我上流式前都会先仔细在显微镜下观察细胞镜下结果，发现镜下结果和流式结果是一致的，镜下观36h的细胞数确实没有24h减少得明显，至于对照组不同时间点的凋亡率差别，我觉得36h和48h差别不大，24h差别大是因为我采集数据时电压没调成跟其他一致的，分析时用统一的设门，所以只有24h的设门没有落在分群最明显的地方，后面我调成一样的电压，差别就不大了

磊子-梦醒十分

niwanmao 发表于 2013-8-9 10:27
1、ANNEXIN V的补偿可以再调一点点，也可以不调，问题不大。按照现在的补偿，可以设一个稍微不一样的十字门 ...

倪老师，不好意思，把这么长时间的帖子翻出来问您，请问这样的十字门怎么画的，calibur的机器也能这样设门吗？

niwanmao

磊子-梦醒十分 发表于 2014-12-21 15:40
倪老师，不好意思，把这么长时间的帖子翻出来问您，请问这样的十字门怎么画的，calibur的机器也能这样设 ...

这种不规则十字门calibur上的cellquest没法画，可以用第三方软件flowjo、kaluza等绘制。

磊子-梦醒十分

niwanmao 发表于 2014-12-22 08:25
这种不规则十字门calibur上的cellquest没法画，可以用第三方软件flowjo、kaluza等绘制。 ...

谢谢了倪老师，冬至快乐！