外周血单个核细胞培养

niwanmao · 发表于 2013-8-11 21:43:51

gaarakang 发表于 2013-8-11 21:20

登录/注册后可看大图

哦，没有说清楚，取血之后混匀，取出500微升刺激5小时，剩下的分离PBMC并培养5天，在最后5小时时刺激，:l ...

分成两部分：
（1）500ul刺激5小时
（2）剩余部分分离PBMC，什么东西都不加培养5天，最后刺激5小时？
那第2部分肯定很难养的，5天啊，原代正常人的细胞养这么长时间很长了，至少在我们这边没人养这么长时间过。

gaarakang · 发表于 2013-8-11 21:45:53

niwanmao 发表于 2013-8-11 21:43

登录/注册后可看大图

分成两部分：
（1）500ul刺激5小时
（2）剩余部分分离PBMC，什么东西都不加培养5天，最后刺激5小时？

培养5天的用RPMI1640加10%的血清

niwanmao · 发表于 2013-8-11 21:51:01

gaarakang 发表于 2013-8-11 21:45

登录/注册后可看大图

培养5天的用RPMI1640加10%的血清

培养基和血清当然是加的，这个我知道，我说的“什么东西都不加”是指刺激的因素。我们这边研究生培养过3天，都是死的多。我就是想知道，你培养5天的目的是什么？真的很难做到，至少在目前的培养方案下。

gaarakang · 发表于 2013-8-11 21:56:00

niwanmao 发表于 2013-8-11 21:43

登录/注册后可看大图

分成两部分：
（1）500ul刺激5小时
（2）剩余部分分离PBMC，什么东西都不加培养5天，最后刺激5小时？

现有几个猜想：
1，是否1640放置4度冰箱谷氨酰胺损失严重导致？
2，想加IL-2，但有人说IL-2会诱导T细胞分化为Treg?
3,血清放置4度冰箱已经超过一个月，且是国产，想换进口血清，并加到20%血清
4，是否细胞密度太大？采用6孔板加2毫升的1640，细胞数10的6次方级别
5，活化T细胞，自己包被抗CD3，是否应该采用抗体包被的磁珠活化更有效
以上的猜想正在一一分析中，有做过的可以交流下哈

gaarakang · 发表于 2013-8-11 21:57:51

niwanmao 发表于 2013-8-11 21:51

登录/注册后可看大图

培养基和血清当然是加的，这个我知道，我说的“什么东西都不加”是指刺激的因素。我们这边研究生培养过3 ...

刺激因素跟5小时的一样啊，PMA和IO刺激，最后BFA阻断胞内因子分泌

niwanmao · 发表于 2013-8-12 13:21:51

gaarakang 发表于 2013-8-11 21:57

登录/注册后可看大图

刺激因素跟5小时的一样啊，PMA和IO刺激，最后BFA阻断胞内因子分泌

不是啊，你前面不是说剩余部分分离PBMC，然后用培养基＋FBS培养5天，这5天应该是没加PMA和IO的啊，我就是说这5天本来就死亡率很高的，原代非肿瘤细胞存在自己的生存周期，基本上活不下来的。

小憨 · 发表于 2013-8-12 20:46:02

我们实验室是分出PBMC后用抗体活化其中的T细胞使其扩增，如果不用抗体活化的话，细胞是很快就死了，但具体为什么死掉我也不知道。一般第五天就死了很多了。

gaarakang · 发表于 2013-8-12 22:11:34

小憨发表于 2013-8-12 20:46

登录/注册后可看大图

我们实验室是分出PBMC后用抗体活化其中的T细胞使其扩增，如果不用抗体活化的话，细胞是很快就死了，但具体 ...

用什么抗体？

gaarakang · 发表于 2013-8-12 22:13:18

niwanmao 发表于 2013-8-12 13:21

登录/注册后可看大图

不是啊，你前面不是说剩余部分分离PBMC，然后用培养基＋FBS培养5天，这5天应该是没加PMA和IO的啊，我就是 ...

5天的最后5小时加刺激剂和阻断剂，恩，很难养活，现在做细胞浓度对它的影响。

niwanmao · 发表于 2013-8-12 22:17:56

gaarakang 发表于 2013-8-12 22:13

登录/注册后可看大图

5天的最后5小时加刺激剂和阻断剂，恩，很难养活，现在做细胞浓度对它的影响。 ...

你怎么还没看懂我的意思，你最后加刺激剂5小时我明白，我前面一直在说你前面纯粹用培养基＋FBS的5天，对于原代细胞培养是非常困难的，这是原代细胞的本身特性决定的，几乎没有人能够养活，这种培养方式最多只能撑1－3天。

账号		自动登录	找回密码
密码			加入流式中文网

[淋巴细胞相关] 外周血单个核细胞培养