一个同型对照选择的问题

niwanmao · 发表于 2013-8-12 20:05:51

gcz5340 发表于 2013-8-12 17:16

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单克隆抗体制备第一步就是抗原免疫动物，产生相关的B淋巴细胞克隆，但是Rat的IL-17(既然同源性高，应该表 ...

以前确实只认为完全不同类的生物才可以用来制备抗体，但实际上现在可以针对个体基因位点产生抗体，叫anti-idiotypic antibody。
参见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12191516

niwanmao · 发表于 2013-8-12 20:06:54

gcz5340 发表于 2013-8-12 17:22

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我也不太喜欢同型对照，最好是阴阳性分的很开，如果是连续表达最好比较实验组和对照组的荧光强度，很难准 ...

我觉得也是这个理，因为有时候有些站友做出的同型对照反而比正常标本荧光强度要高，其实也是这个道理。

niwanmao · 发表于 2013-8-12 20:08:32

haven_t 发表于 2013-8-12 17:06

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为什么不加呢？我觉得加了不是更好。

FMO概念上就是减去一。另外，@gcz5340 郭版所说的同型对照这种差异性可能也是同型对照不好的一个方面。

haven_t · 发表于 2013-8-12 21:04:39

niwanmao 发表于 2013-8-12 20:08

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FMO概念上就是减去一。另外，@gcz5340 郭版所说的同型对照这种差异性可能也是同型对照不好的一个方面。 ...

概念是如此，但从实验设计角度，用同型抗体代替空白不是应该更好吗？FMO减去是为了消除spillover所致的数据弥散，非特异性结合的问题好像仍存在。虽然同型对照与实验抗体有差异，从很多实验来看加同型未必能解决所有问题，但是还是比不加好点，特别是对于分群不清楚的抗原。

dragonhzqsmmu · 发表于 2013-8-12 21:45:16

niwanmao 发表于 2013-8-12 16:43

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我估计他们的意思是用FMO对照，就没必要再用同型对照。这个观点我也基本赞同。
但是现在遇到好多都是只做 ...

单标我们现在用荧光补偿微球代替，然后加做标本的FMO对照，最后上全标，不过这样管数会多不少成本也高，不过效果还是不错的

haven_t · 发表于 2013-8-12 23:04:33

本帖最后由 haven_t 于 2013-8-12 23:05 编辑

dragonhzqsmmu 发表于 2013-8-12 21:45

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单标我们现在用荧光补偿微球代替，然后加做标本的FMO对照，最后上全标，不过这样管数会多不少成本也高， ...

我没做过多色的FMO，但最近有几个学生来做流式，单色标记，用空白对照，这个时候广义来说也算是FMO了。流式的结果是实验管的阴性群体比空白大概高半个数量级左右，在这种情况下空白基本是没有意义的，分析时我对他们解释说是因为抗体非特异性结合的关系，如果以后的实验分群不清晰，最好还是有同型对照作为设门标准。问题是如果FMO空出来的通道什么都不加，是否也会出现上述情况呢？为什么不能加呢？

niwanmao · 发表于 2013-8-12 23:25:13

haven_t 发表于 2013-8-12 23:04

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我没做过多色的FMO，但最近有几个学生来做流式，单色标记，用空白对照，这个时候广义来说也算是FMO了。流 ...

我觉得应该这么理解：
FMO本意是顺应高质量的单克隆抗体而产生的、为多色流式设计的对照，所以在此情况下，荧光渗漏占主要地位，而抗体的背景干扰就变得非常细微，所以此时FMO就可解决设门问题。
但是，当出现你所说的这种背景干扰强的情况，此时说明抗体的非特异性较强，那么FMO中还是需要加上同型对照，以同时消除荧光渗漏和背景干扰。
因此，FMO本意就是不加同型，但是在实验中可根据您的抗体背景高低决定加或不加同型对照，加上同型对照后就脱离了FMO的概念，但仍属于对照范畴。

应该说，目前多数实验都可以选择质量好的单克隆抗体，背景干扰还是次要的，光FMO就可以解决。

haven_t · 发表于 2013-8-13 09:14:42

niwanmao 发表于 2013-8-12 23:25

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我觉得应该这么理解：
FMO本意是顺应高质量的单克隆抗体而产生的、为多色流式设计的对照，所以在此情况下 ...

其实这样做是很矛盾的，在进行配色的时候希望避免spillover，fmo希望spillover来掩盖背景。如果配色方案里面有untouch channel，抗体背景就会变得突出了。

我觉得FMO只是对应spillover的手段而已，如果能按照6准则设计的配色方案无需FMO效果也很好。或者仪器通道足够多，把所有抗体放到untouch channel中就可以避免了spillover，也不需要fmo了。

gcz5340 · 发表于 2013-8-13 10:32:31

dragonhzqsmmu 发表于 2013-8-12 21:45

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单标我们现在用荧光补偿微球代替，然后加做标本的FMO对照，最后上全标，不过这样管数会多不少成本也高， ...

请问你们碰到tandem-dye的时候怎么处理，tandem染料听说每个批次补偿值不一样。

gcz5340 · 发表于 2013-8-13 10:52:12

本帖最后由 gcz5340 于 2013-8-13 10:53 编辑

niwanmao 发表于 2013-8-12 23:25

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我觉得应该这么理解：
FMO本意是顺应高质量的单克隆抗体而产生的、为多色流式设计的对照，所以在此情况下 ...

同型对照主要是为了排除Fc段非特异性结合的干扰，设置FMO主要是因为荧光补偿后阴性背景荧光增强。

有个问题还需要讨论一下，高质量的单克隆抗体固然重要，但其实很多时候和我们的细胞种类也有很大关系，可能每种细胞表达的FcR量不同，非特异性结合也就不同，也就是说：同一种单克隆抗体在不同细胞中可能有不同量的非特异性结合。所以我觉得FMO加上同型抗体应该更严谨吧。

另外，实际操作中似乎用Fc blocking试剂的人很少，不知道大家有什么看法。

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[结构和原理] 一个同型对照选择的问题

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