一个同型对照选择的问题

niwanmao · 发表于 2013-8-13 11:07:02

haven_t 发表于 2013-8-13 09:14

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其实这样做是很矛盾的，在进行配色的时候希望避免spillover，fmo希望spillover来掩盖背景。如果配色方案 ...

其实不是矛盾，FMO并不是为了掩盖背景，而是因为现在的抗体质量提高了，背景已经可以忽略不计了，所以FMO消除渗漏后就可以正确地做出真实结果。

颜色越多，其实独立的通道越少，配色不是为了避免spillover，而是希望使spillover能够可控、可调，尽量小。做10几色的流式，没有补偿怎么可能？

niwanmao · 发表于 2013-8-13 11:12:08

gcz5340 发表于 2013-8-13 10:52

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同型对照主要是为了排除Fc段非特异性结合的干扰，设置FMO主要是因为荧光补偿后阴性背景荧光增强。

有个问 ...

应该说现在多数通过认证的抗体，基本上背景值都是很低的，我觉得可以不加，因为就象你前面所说的，同型对照的影响因素更多，还不如FMO来的单纯。
至于Fc阻断，多数情况下不需要，有时候如果背景明显，例如你前面提到过的同型比阴性标本荧光还要强，此时可能还是要加一下。

didi_zhou · 发表于 2013-8-13 15:14:41

现在很多老外都直接上样品，调电压先（主要是阴性群位置），然后在用BEADS，找补偿值，然后离线补偿结果。

haven_t · 发表于 2013-8-13 17:38:47

本帖最后由 haven_t 于 2013-8-13 17:39 编辑

niwanmao 发表于 2013-8-13 11:07

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其实不是矛盾，FMO并不是为了掩盖背景，而是因为现在的抗体质量提高了，背景已经可以忽略不计了，所以FMO ...

外周血和骨髓这类型临床样本的背景的确很低，所以我从来没有做同型。但我接触过很多科研样本，分离或者培养后的细胞背景很高，如果分群不清晰，不加同型经常是无法分析的，所以对一些科研的标本我还是建议加同型。

上年中美流式会议瑞金会场那个老外的观点我很认同，在10色的仪器上只要避开2~3种荧光素，再按照配色6准则去搭配，spillover的影响会很少，我看他做出来的数据也没有进行FMO，但效果很好。

另外一个是spillover是不可控的，是会随着荧光强度改变而改变。如果大部分的标记荧光强度比较低，spillover就接近0，这时候不加同型就相当于空白对照，当然如果能保证空白和同型荧光强度水平一致的时候我也建议不加。

haven_t · 发表于 2013-8-13 18:42:25

gcz5340 发表于 2013-8-13 10:52

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同型对照主要是为了排除Fc段非特异性结合的干扰，设置FMO主要是因为荧光补偿后阴性背景荧光增强。

有个问 ...

我感觉是骨髓和外周血这些临床的标本非特异性结合比较低，而学生的科研样本比较高。我猜测是临床样本抗体抚育的环境有大量血浆，血浆中有大量免疫球蛋白和白蛋白，可能会饱和掉部分的Fc受体，也有点象westen用BFA阻断受体的原理。而科研样本大部分经过分析培养等处理，Fc受体暴露出来，所以造成如此差别。
以上仅仅是我的猜测，未经核实。郭版接触科研标本比较多，不知道有何高见呢？

dragonhzqsmmu · 发表于 2013-8-15 09:09:40

haven_t 发表于 2013-8-13 18:42

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我感觉是骨髓和外周血这些临床的标本非特异性结合比较低，而学生的科研样本比较高。我猜测是临床样本抗体 ...

那按照老师的说法，临床血液标本我们可以省去FC阻断抗体这一步？这样的话能节省不少经费的

科研样品看情况，如果非特异性染色严重的话再加FC阻断抗体

dragonhzqsmmu · 发表于 2013-8-15 09:17:43

而且按照他们有经验的老师来说也不是所有的通道都需要做FMO，我们因为只有四色通道，刚开始弄都老老实实做四个FMO，他们建议对于分群不清楚的需要加做FMO，一般的不加做FMO

haven_t · 发表于 2013-8-15 15:51:28

dragonhzqsmmu 发表于 2013-8-15 09:09

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那按照老师的说法，临床血液标本我们可以省去FC阻断抗体这一步？这样的话能节省不少经费的

科研样品看情 ...

以我做过的标本感觉是这样，但没有认真去验证过，倪老师@niwanmao和郭版@gcz5340比我有经验，听听他们的说法吧。

niwanmao · 发表于 2013-8-15 16:23:12

dragonhzqsmmu 发表于 2013-08-15 09:09:40

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那按照老师的说法，临床血液标本我们可以省去FC阻断抗体这一步？这样的话能节省不少经费的

科研样品看情

因为我们平时做的都是免疫分型的标本，只需要对荧光强度进行判断，不需要非常精确的百分比等数据，所以一般也不进行Fc阻断，也不会太在乎它有多少非特异性荧光。因此这方面其实我的经验也不足。但是，我个人觉得，如果需要非常精确的百分比，无论临床标本还是科研标本，还是尽可能进行Fc阻断。

刘星宇 · 发表于 2013-8-16 10:15:10

haven_t 发表于 2013-8-13 18:42

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我感觉是骨髓和外周血这些临床的标本非特异性结合比较低，而学生的科研样本比较高。我猜测是临床样本抗体 ...

haven_t老师好，我做人血标本实验，检测胞膜受体表达，抗体说明书推荐的Fc受体阻断剂是人IgG（没有荧光素），我原来做法是在同型对照管和检测管孵育抗体之前都先用人IgG阻断15min，最近一个工程师说我做法严重错误：检测管不应加IgG，IgG作用跟同型对照IgG2B-PE是一样的。？？？我懵了，不知道谁对谁错。

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