抗体孵育时间及温度对结果的影响

刘星宇

pushiming77 发表于 2013-9-12 16:41

                               
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我觉得还是按Kit上来吧，我一般孵育是4℃、30min，没有出现什么问题。在磁珠分选的时候，我用过过长的时间 ...

对于“死细胞荧光强于活细胞”，也很可能是这个原因导致我们的结果百分比高，我之前理解是死细胞就像红细胞、细胞碎片都会聚集到散点图的的左下角。嗯，又找出来了一个原因，看来还是要对干预后的细胞进行活性检测。另外@niwanmao 老师，是不是可能也是这个原因，造成我1%多聚甲醛固定的细胞的百分比高于新鲜组的，而掩盖了荧光淬灭的变化？   

刘星宇

@niwanmao 老师，9月10日晚在线课堂上提到的同型对照管直方图“拖尾”现象，记得当时你们说是死细胞造成，而我再看散点图时，感觉会不会是非特异性结合造成的？

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-9-13 16:12

                               
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@niwanmao 老师，9月10日晚在线课堂上提到的同型对照管直方图“拖尾”现象，记得当时你们说是死细胞造成， ...

你切换到FL1/FL2散点图看看？

pushiming77

刘星宇 发表于 2013-9-13 11:40

                               
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“还有常温下染色对细胞本来就伤害比较大，这样会造成更多的死细胞”。
但很多临床标本都是在常温下处理 ...

一些资料显示，细胞在PBS里，4℃可以存活10h，在常温下只能存活4h，所以细胞提取实验，我们大多在冰上操作。

dragonhzqsmmu

niwanmao 发表于 2013-9-13 12:42

                               
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常温染色对细胞伤害大，我觉得这句话纯粹只是属于理论上的推导，实际操作中我并没有碰到这种情况。 ...

染色温度确实让人挺纠结的，之前老板再国外做实验，那边的科研样品都是在冰上操作，包括现在很多的JOVE的视频中看到的也是，不过回国后因为实验室没有制冰机，另一方面也是图省事我大多数是在室温下操作，个人认为室温下分子的布朗运动肯定要强于4度，所以容易染上，但也有可能导致非特异性染色，所以看到这个帖子还是忍不住插一句，究竟是室温还是4度，太过纠结了

niwanmao

dragonhzqsmmu 发表于 2013-9-14 10:14

                               
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染色温度确实让人挺纠结的，之前老板再国外做实验，那边的科研样品都是在冰上操作，包括现在很多的JOVE的 ...

抗体的结合应该跟布朗运动无关吧？

科研标本错综复杂，一句话说不准。
至少临床标本（血液、骨髓等）都在室温下进行。

刘星宇

dragonhzqsmmu 发表于 2013-9-14 10:14

                               
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染色温度确实让人挺纠结的，之前老板再国外做实验，那边的科研样品都是在冰上操作，包括现在很多的JOVE的 ...

我们9月23日再次进行比较，分两组：1、4℃孵育30、38、45min；2、RT下孵育20、30、40min，结果仍是RT下的明显高于4℃的，而且两组都存在随着孵育时间延长，“受体表达”增高。目前正在和试剂商协商，查找原因。

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-9-13 17:01

                               
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你切换到FL1/FL2散点图看看？

散点图上应该是并没有看到太多死细胞吧？当然这里的单核细胞圈得有问题。

一米阳光Vino

我们实验室用的孵育条件：4℃、30min，经流式分析后，效果挺好的。我也觉得常温下孵育对细胞可能有伤害（个人看法），因为制备好的样（细胞+PBS），一般在常温下都是短时间放置，如果要长时间放置，应该放入冰中。还有，我觉得倪老师说的对，对于不同的细胞，条件应该有所区别，看来我下次实验有必要试一下其他的条件。

niwanmao

一米阳光Vino 发表于 2013-10-21 15:58

                               
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我们实验室用的孵育条件：4℃、30min，经流式分析后，效果挺好的。我也觉得常温下孵育对细胞可能有伤害（个 ...

感谢分享经验。不知道你们用的是什么细胞？细胞株还是临床标本？