全血标本孵抗体后未能及时检测对结果有何影响？

leosurely

刘星宇 发表于 2013-10-27 23:11

                               
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是的，粒细胞离体后，好像是因为呼吸爆发，8h会有不同程度的凋亡。之前还试过先分离中性粒细胞（2个小时 ...

从楼主的描述，应该是抗体孵育完溶血后放了8小时，而且溶血剂含有甲醛固定剂，按道理细胞应该都是固定后的细胞，应该不会发生凋亡吧？而且本人在做类似实验时也发现有时粒细胞分成两群（标本都是新鲜采集的静脉血，标记抗体后溶血立即上机检测），这个问题值得继续探讨。

刘星宇

leosurely 发表于 2013-10-28 15:26

                               
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从楼主的描述，应该是抗体孵育完溶血后放了8小时，而且溶血剂含有甲醛固定剂，按道理细胞应该都是固定后 ...

图一是抗体孵育完溶血后放了8小时的，我也想过细胞固定后，大小形态应该变化不大，只是荧光强度出现变化。而图四是培养8h后，再孵抗体，进行流式检测，图四的应该属于凋亡。
今天的实验发现培养后死细胞确实是很多，但稍比前一次的少。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-10-28 22:45

                               
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图一是抗体孵育完溶血后放了8小时的，我也想过细胞固定后，大小形态应该变化不大，只是荧光强度出现变化 ...

为什么用甲醛，而不是用多聚甲醛？甲醛感觉对细胞影响挺大的，而且毒性大。

刘星宇

公司生产用于beckman 流式仪的溶血素说明书写的是含甲醛

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-10-29 08:35

                               
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为什么用甲醛，而不是用多聚甲醛？甲醛感觉对细胞影响挺大的，而且毒性大。 ...

公司生产用于beckman 流式仪的溶血素说明书写的是含甲醛。我现在能确定的是用他们专用的溶血素，FSC-SSC散点图上粒细胞、单核细胞、淋巴细胞分群比BD公司以及自己配制的氯化铵裂解液好很多很多。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-10-29 15:00

                               
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公司生产用于beckman 流式仪的溶血素说明书写的是含甲醛。我现在能确定的是用他们专用的溶血素，FSC-SSC ...

如果用了之后粒细胞就是分成左右这么两群的，那么就说明裂解液有问题。

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-10-29 18:55

                               
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如果用了之后粒细胞就是分成左右这么两群的，那么就说明裂解液有问题。 ...

倪老师，我意思是用了beckman专用的溶血素后，在beckman流式仪上粒细胞、单核细胞、淋巴细胞分群比之前的溶血素好，至于粒细胞分两群，用之前的溶血素并没有明显出现，但在BD仪器上出现过，应该属于死的粒细胞。。。

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-10-29 18:55

                               
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如果用了之后粒细胞就是分成左右这么两群的，那么就说明裂解液有问题。 ...

在新鲜标本上粒细胞并没有分两群

晨光下的浪子

刘星宇 发表于 2013-10-29 23:46

                               
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在新鲜标本上粒细胞并没有分两群

你好，你也是做血标本是吗？我现在也是用全血，先用一抗二抗孵育后（但我是室温孵育30min），再用红细胞裂解液裂解红细胞，洗涤后上机检测。其实我也想用多聚甲醛固定，因为每天收标本时间不一样，还有我们学校流式机子只能是周二和周五才对我们其他科的学生开放，所以不可能随时上机的。不知道固定后检测会不会好呢？！还有，你们洗涤抗体是用PBA还是PBS啊？！求指教！

niwanmao

晨光下的浪子 发表于 2013-11-21 11:14

                               
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你好，你也是做血标本是吗？我现在也是用全血，先用一抗二抗孵育后（但我是室温孵育30min），再用红细胞 ...

固定是可以的，但我个人建议固定别超过24小时。洗涤抗体用PBS即可。