BDaria2分选Treg细胞

lin850424

niwanmao 发表于 2014-2-24 19:11
一样的，可以自己配制氯化铵裂解液：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-206-1-1.html

谢啦，倪老师，又省2000块钱啊哈哈

lin850424

niwanmao 发表于 2014-2-24 19:11
一样的，可以自己配制氯化铵裂解液：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-206-1-1.html

溶血剂对淋巴细胞没有影响吗？剂量和作用时间多少为宜？

niwanmao

lin850424 发表于 2014-2-24 19:21
溶血剂对淋巴细胞没有影响吗？剂量和作用时间多少为宜？

我们平时做免疫分型是用2ml 1×氯化铵裂解液，作用10分钟，马上离心5分钟去上清。

facetodog

ficoll分离后加1-2ML红细胞裂解液20分钟，离心去上清洗涤一遍

gcz5340

niwanmao 发表于 2014-2-22 23:25
可以通过设置阈值排除，Aria2似乎用的应该也是diva软件，diva软件调节电压的那个面板有一个选项卡是调节t ...

分选的时候最好不要设那么高的阈值，如果直接把红细胞当噪音，那就有可能跟目标细胞一起混着进入收集管了；如果不设阈值，机器就把红细胞当非目标细胞，这样就不会进入收集管，这也是听BD的工程师说的，想想也挺有道理，当时实际操作过程中可以灵活一点，适当设一点也行无妨。

一般来说Ficoll离心后红细胞应该几乎没有啊，是不是淋巴细胞分离液不好啊，换个进口的试试。裂红细胞是一种方法，但怎么也会细胞有点损伤，而且步骤复杂，容易丢失细胞啊。

一般流式分选浓度1-2X10e7的浓度，你这个难点可能是红细胞太多，影响进样速度。

lin850424

gcz5340 发表于 2014-3-4 19:15
分选的时候最好不要设那么高的阈值，如果直接把红细胞当噪音，那就有可能跟目标细胞一起混着进入收集管了 ...

ficoll用的是国产的，天津灏洋的，每一次都或多或少有一些红细胞，用量比较大，如果用进口的有点浪费啊，用了裂解液好多了，现在效率80%左右，问题是我回测纯度的时候为什么纯度这么低呢，小于80%，一方面可能PBS有杂质，正在排除中，还有没有可能荧光淬灭了啊，分选大约需要一个半小时，分选装置的灯总是在照射流式管啊，这个应该有影响吧，因为回测纯度的时候总是有一部分门外的细胞（我要的是CD4+CD25high的T细胞，回测的时候会出现一部分CD4+CD25LOW的细胞，按理说应该是没被分选到的啊）

niwanmao

lin850424 发表于 2014-3-10 10:31
ficoll用的是国产的，天津灏洋的，每一次都或多或少有一些红细胞，用量比较大，如果用进口的有点浪费啊， ...

我没做过分选，但记得看过分选的材料时提到过，这个设门分选其实对于机器来说只是一个模糊的概念，所以即使你设了CD25high的门，也是有可能会分选到一些CD25low的细胞，这是正常的。

lin850424

niwanmao 发表于 2014-3-10 10:41
我没做过分选，但记得看过分选的材料时提到过，这个设门分选其实对于机器来说只是一个模糊的概念，所以即 ...

那我这纯度怎么保证啊？其实我也觉得本身CD25分的就不开，机器怎么可能分选这么精确呢，但老觉得这是给自己找理由呢