求推荐补偿微球

家的感觉

niwanmao 发表于 2016-3-21 19:38
所有机器都一样，自动补偿那是作为一个参考，实际上最后还是需要根据样本进行微调，至少我做过十色，微球 ...

谢谢，您说根据样本进行微调是通过样本的单染管来调节是吗?

niwanmao

家的感觉 发表于 2016-3-22 08:35
谢谢，您说根据样本进行微调是通过样本的单染管来调节是吗?

是的。如果对样本各类细胞的表达特点很清楚，那么也可以直接上实验管进行调节。

小憨

微球我见过两种，一种是阴性微球阳性微球各一瓶，用的时候混在一起，比如BD的；另一种是阴性、阳性直接混好的。我觉得第二种比较方便。我自己常用ebioscience，但其他厂家也有，都可以选用（并不想给它家打广告）。
另外微球上其实包被的应该是Fc受体，可以与所有抗体结合；但是非抗体的比如Annexin V、PI、DAPI、7-AAD等就不能结合，所以这些染料的补偿就不能用微球调了。

INTORNS

小憨 发表于 2016-3-23 10:04
微球我见过两种，一种是阴性微球阳性微球各一瓶，用的时候混在一起，比如BD的；另一种是阴性、阳性直接混好 ...

好的。
谢谢您的回答。
目前已经使用了Beckman的补偿微球，是阴性微球和阳性微球分开的。效果还好的，也不怎么麻烦。

didi_zhou

家的感觉 发表于 2016-3-21 15:49
@niwanmao 各位老师我有个关于补偿的问题，最近中山大学的吴长有老师过来讲座，他说他们做十几色时都是用 ...

大多机器都有自动补偿程序，一般程序是先上Blank/ISOtype，这个主要是确定电压用。然后上单染管，这个时候你可以选择用微球还是细胞。如果用细胞的话可以省掉第一步，就是Blank或者Isotype，当然可能每个机器的程序会有点不一样。用细胞的结果比较准确，但是电脑计算必须要有阴性群与阳性群两群才能计算补偿，而细胞有时候会出现只有峰移（阳性）、或没有阳性、或表达未知的情况，这个时候用微球就可以完全满足计算的条件。确定好了单染管的阴阳性软件就会自动计算补偿矩阵。当然细胞与微球的结合率与强度会有一定的偏差，大多数情况下微调一下就好。

记得第一步用细胞调完电压以后，不要因为微球的原因再动电压，不然计算会不准。

小憨

INTORNS 发表于 2016-3-23 18:04
好的。
谢谢您的回答。
目前已经使用了Beckman的补偿微球，是阴性微球和阳性微球分开的。效果还好的，也 ...

其实也不麻烦，但有的时候我会忘了哪种加了哪种还没加，哈哈哈~尤其同时干太多事儿的时候。

小憨

家的感觉 发表于 2016-3-21 15:49
@niwanmao 各位老师我有个关于补偿的问题，最近中山大学的吴长有老师过来讲座，他说他们做十几色时都是用 ...

单阳是肯定要做的，否则没法获得所医用抗体的荧光信息。吴老师说的“自动补偿”应该是指在获得单阳样品的数据后，利用软件自动计算补偿值，这种功能好多流式软件都具备的，比如flowjo，你只要告诉它哪个样品是哪个染料单阳就可以的，它会自动圈出阴性、阳性群，再根据平均荧光强度或其他指标调节各个通道的补偿值。
但是我自己有经验跟大家分享一下，我会调节一次补偿值然后用于多次实验。但须满足以下几个条件：1. 抗体相同（即同一支抗体，同品牌同批次一支打开用了好久，另外一支没打开都不行）2. 环境温度相同，机器状态相同（我们的流式是放在恒温房间里的，而且只要是近期的实验，我都会开机跑去离子水10 min让各个荧光通道的PMT预热）3. 荧光通道的电压不改变

家的感觉

@小憨 非常感谢您的回复，很详细。麻烦再问一下，“3. 荧光通道的电压不改变”指的是这几次同一个通道电压不变，如果通道电压发生改变就必须重做补偿是吗？还有如果仪器重做了质控，其他没变，是不是可以用同一个补偿值？重做质控后会不会导致荧光通道电压发生改变？谢谢！

niwanmao

家的感觉 发表于 2016-3-24 15:31
@小憨 非常感谢您的回复，很详细。麻烦再问一下，“3. 荧光通道的电压不改变”指的是这几次同一个通道电压 ...

改变电压肯定要改变补偿的。你所说的重做质控，是指什么质控？BD的CS&T质控？

家的感觉

niwanmao 发表于 2016-3-24 20:32
改变电压肯定要改变补偿的。你所说的重做质控，是指什么质控？BD的CS&T质控？ ...

恩，就是CST质控，如果今天重做了质控，会不会导致同一荧光的电压发生改变