大鼠外周血免疫表型探索，请各位给挑挑毛病

niwanmao

zark_00 发表于 2014-8-4 12:51
我就是确定不了啊。你看161a的1,2,3图，CD3-CD161a-区域，细胞分群每图都不一样。我在想是否是补偿做得 ...

你试试将下图中这群细胞圈中，反过来看看它在FSC/SSC散点图上的位置：

zark_00

昨天做了下6色染，CD161a的问题还是存在。查了下，标记大鼠NK的抗体，BD只有CD161a，克隆型10/78，Biolegend 只有CD161 克隆型3.2.3。请问有用过这两种抗体的么。再看CD161a的TDS，上面说除了NK和部分T细胞外，大鼠树突细胞和外周血中的部分单核细胞也不同程度表达CD161a，按我的结果，有可能那群双阴性附近的群体是树突？单核？
附上结果图片和源文件，源文件载入后前十个就是同型对照，单染*6，样本（1,2,3）源文件不是分卷压缩的，三个都要解压，然后放到同一个文件夹中，就行。

zark_00

自己顶下，倪老师，各位战友，快来啊

niwanmao

zark_00 发表于 2014-8-12 14:13
昨天做了下6色染，CD161a的问题还是存在。查了下，标记大鼠NK的抗体，BD只有CD161a，克隆型10/78，Biolegen ...

挑了两个文件，看到CD161a中等表达和高表达的细胞部分重叠：
高表达部分：CD3阴性。
中等表达部分：分布范围更广，在CD161和CD4散点图上，可以看到那淋巴细胞区域的CD161和CD4双阳性，而单核和粒细胞区域的只有CD161单阳性CD4阴性。

所以，我在想，你如果仅仅要研究淋巴细胞的CD161a，我建议还是用CD3设门，或加上CD4设门。

zark_00

niwanmao 发表于 2014-8-13 22:20
挑了两个文件，看到CD161a中等表达和高表达的细胞部分重叠：
高表达部分：CD3阴性。
中等表达部分：分布 ...

倪老师你好，我这几天也做了些尝试，CD161a弱阳性那群细胞确实是CD4+,我查了下，CD4在单核细胞上也表达，而CD161a在某些情况下也在单核细胞上表达，所以可能的问题就是设门的问题，但设门和细胞群体是否明显分开又有关，所以我推断又跟裂解有关系了。

用BD的pharmlyze 系列裂解液 10，15,20,25,30分钟裂解都做过，时间短，肉眼可见红细胞残留多，而且细胞碎片多，时间长，肉眼可见红细胞无，但碎片和粒细胞碎片超多。关键是上机后FSC vs ssc 得不出较典型的图，正常的淋巴细胞群体本来是椭圆群体横着的，我的成了桃心形往右倾（图像放大后就是这样）。还有，CD45 VS SSC图，领导非要ssc轴对数设置，细胞群体分布被压缩，这样的话，有可能误圈了单核（我还回顾了下结果，换成SSC线性，在CD45 VS SSC图中，单核和淋巴细胞没有明显界限（猴血样本就相对好些），很像一个群而不是两群，如果只圈认定的那群的话，会被质疑）。

跟BD 技术支持也联系了，他们说常温裂解30分钟内，应该得到比较典型的图，也给我发了他们的结果图，确实比较典型。但我就是得不出来。为了验证是否机器有问题，我拿猴血试了试，10分钟裂解就很彻底，淋巴细胞群分得很好，也比较典型。

我下周不行就只有换裂解液尝试了，BD FACS系列的，ebioscience的多种属通用裂解液（说明书上说大鼠能用），请问倪老师，我还应该怎么去尝试。

订试剂要花时间，不是现货更惨，怎么交差啊

niwanmao

zark_00 发表于 2014-8-16 16:29
倪老师你好，我这几天也做了些尝试，CD161a弱阳性那群细胞确实是CD4+,我查了下，CD4在单核细胞上也表达， ...

你要不试试氯化铵裂解液试试。至少我在平时临床标本中使用，个人觉得细胞分群比商业裂解液好看。

zark_00

niwanmao 发表于 2014-8-16 20:57
你要不试试氯化铵裂解液试试。至少我在平时临床标本中使用，个人觉得细胞分群比商业裂解液好看。 ...

已经尝试过氯氨盐裂解液了，自配的，NH4Cl，KHCO3和EDTANa2，按配方配的。在做商品化裂解效果时就对照过了，10，15,20分钟裂解，肉眼可见红细胞相对商品化得好些，但上机后，还是淋巴细胞群体不典型，粒细胞损伤大。

不行，下周我就缩短裂解时间，不固定裂解时间，等所有管中都红色透明后（绝对小于10分钟，可能5分钟以内），就去离心弃上清看看。10分钟裂解的血样，上机后淋巴细胞群体呈桃心状，我怀疑有部分淋巴细胞损伤大，颗粒度增加，所以才会在典型群体的头部SSC增大。

niwanmao

zark_00 发表于 2014-8-16 21:32
已经尝试过氯氨盐裂解液了，自配的，NH4Cl，KHCO3和EDTANa2，按配方配的。在做商品化裂解效果时就对照过 ...

按照这个配方：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-178-1-1.html

zark_00

今天拿两只鼠血 不染色，只裂解，试了试缩短裂解时间，按 90秒，150秒，3分钟，5分钟，为时间点。两次350g 5分钟离心，不固定，直接上机。

结果是，时间越短的，FSC VS SSC 上，群体分布越明显，淋巴细胞群体和碎片彻底分开，也比较像典型图像中的群体了。更奇怪的是，5分钟时间点的，反而有较多红细胞残留（肉眼），其他时间点均效果较好。

但是由于没有染CD45和CD161a 等，不知道缩短时间裂解，对 CD45 VS SSC 图上，淋巴细胞群体和单核细胞群体能否分开有无影响（我是采用CD45 VS SSC 图上，圈CD45+SSCdim 群体为淋巴细胞群体。

niwanmao

zark_00 发表于 2014-8-17 11:58
今天拿两只鼠血 不染色，只裂解，试了试缩短裂解时间，按 90秒，150秒，3分钟，5分钟，为时间点。两次350g  ...

按照处理人标本的经验，用我上面给你的氯化铵裂解液配方（不要用别的配方），共裂解10分钟，其中加入裂解液时、裂解第5分钟各拿出来涡旋振荡一次。最后1500转/分离心5分钟，效果较好。