大鼠外周血免疫表型探索，请各位给挑挑毛病

zark_00

更新下探索进度：
1 与BD技术支持沟通，从BD总部得到的消息是，确认CD161a会与单核细胞结合，而用常规裂解方式，避免不了有单核细形变，混进CD45 VS SSC 或 FSC VS SSC 图中的淋巴细胞群体中，所以在CD3 VS CD161a 图上，是会有一群CD161弱阳CD3-的群体的。
2 用BD FACS系列裂解液（临床用），2ml：100ul 裂解大鼠全血，加完混匀，直接离心，红细胞完全消失（这款裂解液很猛），但难有肉眼可见白细胞群体，上机后，FSC vs ssc 图上分群清楚，可轻易分出淋巴细胞群体（此时CD45抗体已用光，暂时用FSC vs ssc 中淋巴细胞群体设门），用3.2ng（没错，纳克）/百万细胞的CD161a与其他抗体染色后，CD3 VS SSC 图上那群混杂细胞消失，单阳，双阳，单阴，双阴群体分布清晰且完全分开。

zark_00

今天再用已有抗体，做CD3 CD8a CD45RA CD161和临床裂解液做尝试，在最后上机前加了固定的一步，（BD的固定液 250ul 半小时），最后离心洗去固定液，重悬上机。结果与上次有差异，FSC vs ssc 图上淋巴细胞群体不能很好的分开，CD3 VS CD161a上混杂细胞群体又出现了（CD161a 梯度为0.4ug，0.08ug，0.016ug，0.0032ug），前三个梯度都有杂细胞，只有最后一个没有，原因可能是CD161a浓度过低，杂细胞结合不多强度减弱，往双阴区域移动了。请问倪老师，这样做是否取巧了，做到3.2ng的用量，业内眼光看能不能做。（比例跟前三个梯度略有下降，但不多，NK细胞比例）

niwanmao

zark_00 发表于 2014-9-1 22:04
今天再用已有抗体，做CD3 CD8a CD45RA CD161和临床裂解液做尝试，在最后上机前加了固定的一步，（BD的固定 ...

正常的CD161a细胞分群分的好吗？

zark_00

我分析今天加了固定，和那天没加固定的结果差异问题。我的思考是

BD FACS系列裂解液是15%的多聚甲醛和50%的二甘醇还有其他未知成分。平时我们固定都是1%的多聚甲醛半小时，是否高浓度的多聚甲醛，固定时间就缩短了，用这款裂解液在裂解的同时就已经算固定了（即使加完裂解液不孵育，直接离心，也有5分钟离心时间，一样在裂解和“固定”），而且固定得正合适，细胞损伤在可接受范围内。然而，我又加了一步固定，1%多聚甲醛半小时，就造成了过度固定，多聚甲醛进一步破坏了细胞，使得单核细胞形变，混进了淋巴群体。

请问倪老师，存不存在过度固定一说，一直固定下去，不终止，不离心弃上清，细胞是否会被持续破坏？或者说我上述思路是否合理？

明天我将会做两套样品，用BD FACS系列裂解液，一套不单独固定，一套固定（固定就是1%多聚甲醛半小时，然后终止，离心弃上清，然后staining buffer重悬，储存在4度），来看看fresh和储存24hr，48hr，72hr后上机的情况，如果，没有单独固定的样品与固定样品一样坚持到这几个时间点，那就证明了我用这款裂解液，在裂解时就已经固定好了，无需再单独固定

zark_00

niwanmao 发表于 2014-9-1 22:08
正常的CD161a细胞分群分的好吗？

分得好，四个梯度，都与双阴性群体分得很开，而且前三个梯度，位置一点都没变 10的5次方位置，到最后一个梯度时，CD161a为纵轴的话，CD161a+群体才略往下移到10的4次方左右位置，

niwanmao

zark_00 发表于 2014-9-1 22:21
分得好，四个梯度，都与双阴性群体分得很开，而且前三个梯度，位置一点都没变 10的5次方位置，到最后一个 ...

荧光强度降的太多，我建议你还是用前面那个浓度。
至于单核细胞，你把SSC改为log模式，就可以更好地区分单核和淋巴细胞了。试试看。

zark_00

niwanmao 发表于 2014-9-1 22:33
荧光强度降的太多，我建议你还是用前面那个浓度。
至于单核细胞，你把SSC改为log模式，就可以更好地区分 ...

哦，请问倪老师，SSC改LOG模式，图像不是被压缩了么，都缩到SSC轴的顶部去了，我也试过，分不开，您能发张分淋巴细胞的图么，我参考下，谢谢

niwanmao

zark_00 发表于 2014-9-1 22:36
哦，请问倪老师，SSC改LOG模式，图像不是被压缩了么，都缩到SSC轴的顶部去了，我也试过，分不开，您能发 ...

见下图，P1淋巴，P2单核：

zark_00

niwanmao 发表于 2014-9-1 22:44
见下图，P1淋巴，P2单核：

SSC和CD45都用的H？而且SSC是对数，是不是用A的效果不好，我就用的A。
还有，倪老师，我关于BD FACS系列裂解液 疑似有固定作用的思考，您觉得怎么样，是否有这个可能，还有就是是否有过度固定一说，谢谢

niwanmao

zark_00 发表于 2014-9-1 22:53
SSC和CD45都用的H？而且SSC是对数，是不是用A的效果不好，我就用的A。
还有，倪老师，我关于BD FACS系列 ...

BD的机器A和H效果差不多，有些机器可能H好一些，这个不是问题。

BD的裂解液是有固定成份，但没有固定过度一说，可能还是标本本身的问题。