实例告诉您，为什么抗体滴定这么重要？

decade911

niwanmao 发表于 2015-9-13 20:34
sca-1和c-kit在你检测的细胞中可能呈连续表达，但在一些干祖细胞表面是可以分群很明显的。所以你可以采用 ...

我就是用c-kit和sca-1双阳性并结合lin-来分析干细胞的。直接用骨髓细胞悬液来做抗体滴定有意义吗？不太好找能分群很明显的细胞。

niwanmao

decade911 发表于 2015-9-13 22:48
我就是用c-kit和sca-1双阳性并结合lin-来分析干细胞的。直接用骨髓细胞悬液来做抗体滴定有意义吗？不太好 ...

建议你找这两个标记表达分群明显的细胞来滴定抗体。例如临床AML初发病人很多都高表达CD117(c-kit）

decade911

niwanmao 发表于 2015-9-14 09:05
建议你找这两个标记表达分群明显的细胞来滴定抗体。例如临床AML初发病人很多都高表达CD117(c-kit） ...

我做小鼠的造血干细胞的，这种分群明显的细胞不好找。我前几天做了下滴定，Lineage-V450抗体是20微升SI最高(滴定了20,10,8,5,2.5微升），Sca-1-PECY7和c-kit-APC是1微升SI最高（滴定了10,8,5,2.5,1微升）。不知道滴定的结果可不可信。另外阳性比例也相差悬殊，有点困惑了。流式真是越弄越复杂了，不知道哪个算是个准。。。
附图：

从下到上抗体量逐渐减少

niwanmao

decade911 发表于 2015-9-14 14:12
我做小鼠的造血干细胞的，这种分群明显的细胞不好找。我前几天做了下滴定，Lineage-V450抗体是20微升SI最 ...

哦，小鼠的确实有点难找。分群不好的你就不能用信噪比或者染色指数来衡量染色效果了，所以还是按照参考用量吧。
至于你所说的Lin是混合性抗体，也不适合计算，而且计算不是你所想的那样，你好像是把标本管作为阳性峰，然后另一管阴性管作为阴性峰。正确的信噪比计算应该是把同一管中的阳性峰MFI除以同一管中的阴性峰MFI。

decade911

niwanmao 发表于 2015-9-14 18:39
哦，小鼠的确实有点难找。分群不好的你就不能用信噪比或者染色指数来衡量染色效果了，所以还是按照参考用 ...

计算是没错的，计算染色指数和信噪比时都是同一个样品的，我只是把梯度稀释染的细胞叠加了而已，另外买的BD抗体，没有推荐使用量。。。。。
后来我用FlowJo重新处理了下，这种情况下能用染色指数评价染色效果吗？倪老师帮忙看看吧。
另外flowjo里面有sd和robust sd之分，我看flowjo视频教程时是使用robust sd，这两者有什么区别呢？谢谢了。
附图：

从左至右浓度逐渐降低

niwanmao

decade911 发表于 2015-9-14 22:42
计算是没错的，计算染色指数和信噪比时都是同一个样品的，我只是把梯度稀释染的细胞叠加了而已，另外买的B ...

不仅仅是同一个样本的问题，而是说要一管标本中，同时存在一个阳性峰和一个阴性峰，不能叠加，叠加就不正确了。

decade911

niwanmao 发表于 2015-9-15 08:07
不仅仅是同一个样本的问题，而是说要一管标本中，同时存在一个阳性峰和一个阴性峰，不能叠加，叠加就不正 ...

那我还是没说清楚。计算是没问题的，我算的是一个管里的阳性和阴性的MFI比率及SI，这个不用担心。之所以叠加起来就是想看看峰迁移的情况，因为这三个抗体的阴阳性分群不太明显。麻烦倪老师帮忙看看下图这种情况下，抗体滴定实验的可靠性怎么样（我是利用flowjo里的数据串联功能将阴性及梯度稀释染色的样本在一个图里显示了）：

下图是flowjo里的染CD8的示例数据：

niwanmao

decade911 发表于 2015-9-15 09:15
那我还是没说清楚。计算是没问题的，我算的是一个管里的阳性和阴性的MFI比率及SI，这个不用担心。之所以叠 ...

哦，计算没问题就行。叠加到一起呢可能比较直观吧，不用计算就通过肉眼看出来，呵呵。

kityshao

请问，对于分群不明显的细胞，比如外周血中的EPC，该如何做抗体滴定呢？

niwanmao

kityshao 发表于 2016-8-21 12:47
请问，对于分群不明显的细胞，比如外周血中的EPC，该如何做抗体滴定呢？

有没有办法找到表达该种抗原的同种属细胞？如果有，就用那种细胞，如果找不到，可能就只能参考厂商建议了。