foxp3染色问题求助

niwanmao

奇天 发表于 2016-9-22 16:34
倪老师帮看看这个说明书是不是有问题

我们在临床上用CD4、CD25、CCR4、CD127来圈Treg的，所以我自己没有foxP3的图，但是给研究生做过一些，确实分群还不错的，就像下面这幅eBioscience网站上的图那样。说明书的步骤应该还好啊，你觉得哪里问题？

niwanmao

她说加油JJ 发表于 2016-9-22 18:21
你好，我想请教您做TH17的具体方法，我是提PBMC后培养刺激，染CD4 IL-17效果一直不理想，CD4分群不好，IL-1 ...

CD4需要破胞内或者用Quin2 AM阻止CD4下调：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4750-1-1.html

IL-17染不好，我觉得需要从破膜效果、抗体两方面进行依次排除。

奇天

niwanmao 发表于 2016-9-22 19:36
我们在临床上用CD4、CD25、CCR4、CD127来圈Treg的，所以我自己没有foxP3的图，但是给研究生做过一些，确 ...

我发的图片的说明书中加入FIX/perm后孵育的时间太短了，只有20分钟，之后又用staining buffer（没有透明功能）洗了一遍，随然之后又用prem洗了一遍，并且又加perm孵育了15min，但是我觉得时间还是短，按照这个说明书做过，效果不好。还有加foxp3只孵育了30min。这些和下面帖子中的方法不一样，下面的孵育过夜，染色前后不用staining buffer洗，foxp3孵育时间2小时
小鼠Treg，加入foxp3后，所有群体都往foxp3阳性方向移动
http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4146-1-1.html
(出处: 流式中文网)

niwanmao

奇天 发表于 2016-9-23 09:07
我发的图片的说明书中加入FIX/perm后孵育的时间太短了，只有20分钟，之后又用staining buffer（没有透明 ...

效果好的破膜剂一般30分钟～60分钟足够了。

xuexi-ing

您好，应该是抗体的问题吧，我们这边用的也是eBi的，固定破膜分别30min即可
另外我想请教一下您的Th17是指IL-17吗？这个你需要刺激吗？还是胞内操作直接就能染出来？

niwanmao

xuexi-ing 发表于 2019-12-19 19:27
您好，应该是抗体的问题吧，我们这边用的也是eBi的，固定破膜分别30min即可
另外我想请教一下您的Th17是指I ...

准确的说，Th17指的是细胞，IL-17A指的是细胞因子。通过染胞内细胞因子IL-17A可区分出Th17，这样说才比较正规。
需要刺激！！！！

xuexi-ing

niwanmao 发表于 2019-12-19 20:14
准确的说，Th17指的是细胞，IL-17A指的是细胞因子。通过染胞内细胞因子IL-17A可区分出Th17，这样说才比较 ...

好的，谢谢倪老师解答