流式分选时EGFP与mcherry的激发光波长选择

Vivivivi

     构建的载体上含有两个报告基因EGFP与mcherry，转染细胞后在荧光显微镜下观察可以明显的看到红绿荧光，接下来要做流式分选，检测两者在细胞书评的表达量以及分选出含红色荧光与绿色荧光的细胞，通道应该怎么选择？绿色选FL1，红色选FL3？看资料说mcherry的激发波长是594，也有说561，可以直接选择通道FL3来分析结果么？
   跪求解答，实验卡在这里已经两个月了，跪求

lijh

分选仪配有561激光器，mcherry首选肯定是561。如果分选仪没配561激光器，也可以用488激光器，选择PE通道，但如果mcherry本身荧光比较弱，或表达比较少，用488激光的话，极有可能是看不到。如果mcherry很强的话，是可以看到的，这时EGFP与mcherry要调一下补偿。

家的感觉

mCherry的最大吸收/发射峰分别位于587nm和610nm，对光致漂白耐受，荧光非常稳定。

Vivivivi

家的感觉 发表于 2017-3-2 08:26
mCherry的最大吸收/发射峰分别位于587nm和610nm，对光致漂白耐受，荧光非常稳定。
  ...

万分感谢！

Vivivivi

lijh 发表于 2017-3-1 15:05
分选仪配有561激光器，mcherry首选肯定是561。如果分选仪没配561激光器，也可以用488激光器，选择PE通道， ...

那么请问，我在分选绿色荧光时的通道选择应该是哪一个？FITC么？万分感谢您的回答，帮助很大！！！

a86856635

如果egfp和mcherry在一个载体上只分选egfp就可以了，mcheery及时可以在488nm激发荧光强度也是很弱的，信号也会被egfp掩盖掉

Vivivivi

a86856635 发表于 2017-3-2 16:31
如果egfp和mcherry在一个载体上只分选egfp就可以了，mcheery及时可以在488nm激发荧光强度也是很弱的，信号 ...

那也就是说一个载体上有EGFP和mcherry的话，我只筛选绿色荧光的细胞，就可以不管红色荧光是否被激发或者激发的效果好不好，直接用488nm激发EGFP然后选择FITC通道，分选就可以了是么？

a86856635

是的，同时做一个单细胞孔板分选更容易得到纯的阳性克隆

Vivivivi

a86856635 发表于 2017-3-3 09:24
是的，同时做一个单细胞孔板分选更容易得到纯的阳性克隆

单细胞孔板？什么意思呢？

happyeday

Vivivivi 发表于 2017-3-4 18:01
单细胞孔板？什么意思呢？

我想是指每个孔只分一个细胞，由一个细胞长成一个细胞克隆。一般使用96孔板