如何避免Pecy7分选培养后再上机解偶联成Pe

zhangyy

请教一下各位老师：

我目前的实验设计是用一些流式抗体（包括FITC,APC,PECY7）分选出我想要的细胞亚群，共培养1天后检测PE的表达，但发现检测出来不该有PE的地方有了PE，而该有的PECY7的比例下降，考虑是因为PECY7解偶联成了PE，而我们学校的流式机子是5色，因此换染料避开PE也较为不现实，想请教一下各位老师，如何才能防止PECY7解离成PE呢？

Arcrain

FL3通道是什么激光和BP?

你这是四色方案?

深红长波长荧光染料目前也只有偶联染料可用. 要避免会解离的偶联染料(严格避光有助于减少断裂),一个是看看是不是有更短波长的可用通道,

另一个,APC对应的640或633nm激光光路上, 估计不会只有APC这一个通道吧, 可以看看ALexa700是不是可用?或者, APC-H7亮度很低,但稳定性较好,不知道能不能用.

抗体克隆号对细胞基本没有刺激性的话就不用换.

niwanmao

你是标记完抗体再培养？

zhangyy

niwanmao 发表于 2017-11-20 08:39
你是标记完抗体再培养？

是的倪老师，我是加了标记的流式抗体去分选了，再把分选的细胞拿出来共培养1天后上机检测的。

niwanmao

zhangyy 发表于 2017-11-20 08:51
是的倪老师，我是加了标记的流式抗体去分选了，再把分选的细胞拿出来共培养1天后上机检测的。 ...

培养1天后，这些抗体理论上应该都掉下来了，你这是什么细胞，分裂速度这么慢？

zhangyy

niwanmao 发表于 2017-11-20 08:54
培养1天后，这些抗体理论上应该都掉下来了，你这是什么细胞，分裂速度这么慢？ ...

是淋巴细胞，老师，培养1天后上机检测了，即使我不补加想看的抗体，在原来用来分选的染色通道上也仍然能够检测到信号。

Arcrain

提高具体的激光器和荧光通道的信息,才好选择替换染料.

zhangyy

Arcrain 发表于 2017-11-20 09:02
提高具体的激光器和荧光通道的信息,才好选择替换染料.

FL1 是525BP，染的FITC；
FL2是575BP，染的PE；
FL4是675BP，染的APC；
FL5是755BP，染的PECY7。

zhangyy

Arcrain 发表于 2017-11-20 14:12
FL3通道是什么激光和BP?

你这是四色方案?

谢谢！

FL3是620BP，用的ECD染料，但是下次打算不用了，因为实验室存ECD-CD4效果不好了，下次打算用磁珠分选，还能省一个通道；

下次我共培养的时候在上面覆一层锡纸/避光膜，尽量避免Pecy7的解偶联。

因为我目前有的染料就是pecy7，想染的分子CD8b也没有找到ALEXA700或APC-H7，如果实在不行，就把CD8b换成APC，把其他要染的分子换成ALEXA700的~  这也是个解决办法~


再次感谢！

niwanmao

zhangyy 发表于 2017-11-20 14:57
谢谢！

FL3是620BP，用的ECD染料，但是下次打算不用了，因为实验室存ECD-CD4效果不好了，下次打算用磁珠 ...

仅仅培养一天的话，并且串联染料影响如此之大的话，可能只能把串联染料都换掉了。