“测定不同时相膜蛋白比例”
(1)加入连接荧光的抗体到细胞中使其与膜蛋白结合后,PBS洗去未结合的抗体(防止之后的破膜操作使抗体与膜内蛋白结合),用4%多聚甲醛固定细胞30分钟(一是为了使细胞停止在所处的时相,不再进行有丝分裂,二是为了防止破膜染核时膜蛋白离开原本的细胞,影响某一时相膜蛋白量),用”细胞周期检测试剂盒“中的RNase37度水浴孵30分钟,再用PI染液(据试剂商说,里面已经含有破膜成分)4度孵育30分钟,上机器检测
(2)膜蛋白与抗体结合后,4%多聚甲醛固定30分钟,37度DAPI染核。
很明显,DAPI染核操作更简便,也免去了我的担忧(害怕破膜会使膜蛋白从原本的细胞膜表面离去),有不少文献表明DAPI染核用流式测细胞周期是可行的,但一直以来PI更为常用,我们这边流式老师否决了我用DAPI做流式,说是原理不同(我表示很迷茫呀,一点都没有倪老师的耐心 )还有就是我们这边的紫外激光是405 nm,DAPI激发光是355nm,有些偏差 |