PI染色法用于流式细胞仪区分死活细胞配方问题

niwanmao

HYL20180112 发表于 2018-1-25 18:07
老师，我用0.22微米的荧光微球测试了，大概在400FSC-H左右。但是PI染色的效果不是很好，我用的PI工作液浓度 ...

不用加RNA酶。
你说的染色效果不好是指什么？检测通道你要注意选择正确。

郭英华

浓度越高，染色时间越短。自己可以先用显微镜观察下。

紫宛半夏

求问，楼主用PI 和SYBR做海水细菌活死鉴定的时候怎么圈门啊？我现在做双染区分环境水样的活死细胞，没有分群，不知道怎么圈

RIBB

niwanmao 发表于 2018-1-25 20:44
不用加RNA酶。
你说的染色效果不好是指什么？检测通道你要注意选择正确。 ...

老师你好，我用PI染色死细胞，荧光显微镜下看到死细胞被染上，活细胞没被染上，但用流式检测细胞并没有分群，只有一个峰，荧光强度在10*4左右。我想问下跟流式检测机器有没有关系，我用的不是BD的是cytoflex的，这个机器阴性的荧光强度最小只能是10*3，不想BD可以是10x10，有没有可能是这个机器没法两群细胞分开呢？
谢谢！

niwanmao

RIBB 发表于 2019-8-23 10:13
老师你好，我用PI染色死细胞，荧光显微镜下看到死细胞被染上，活细胞没被染上，但用流式检测细胞并没有分 ...

不明白你用的是什么仪器，cytoflex是Beckman的，不是BD的。
你有没有试过把PI坐标设为线性？

RIBB

niwanmao 发表于 2019-8-25 17:12
不明白你用的是什么仪器，cytoflex是Beckman的，不是BD的。
你有没有试过把PI坐标设为线性？ ...

我的意思就是用的beckman的cytoflex，不是用的BD仪器。我试了改为线性，还是没有分成两群。我看您在论坛里说孵育1min即可上机检测，我看试剂盒有的说37度孵育30min，有点困惑。
我的实验目的是用PI染死细胞，荧光显微镜下拍照直观比较实验组和对照组死细胞多少，然后再收集细胞流式上机检测做个定量比较。我是买的PI粉末，先用纯水溶解到1mg/ml,然后用PBS稀释到8uM，然后1ml加20ul孵育15min镜下观察再流式上机检测。
反复做了几次，镜下观察没问题，活细胞不发光，死细胞发红光，但是流式上机检测老是没有对应的结果，不知道是什么原因，会不会我这PI染色工作液配置方法不行？下图1 2的图注编辑反了，就是想做出这种图，但一直不成功，还望倪老师指点迷津，甚是困惑，十分感谢！！

niwanmao

RIBB 发表于 2019-8-25 20:47
我的意思就是用的beckman的cytoflex，不是用的BD仪器。我试了改为线性，还是没有分成两群。我看您在论坛里 ...

PI一般用10ug/ml，取5－10ul加入100ul样本中，染色1分钟即可。
如果你放置时间过长了，像你帖子所说，先在镜下看，然后再上机，这时间过得长了，再加上你这里浓度特别高，所以就全染上了。

RIBB

niwanmao 发表于 2019-8-25 23:04
PI一般用10ug/ml，取5－10ul加入100ul样本中，染色1分钟即可。
如果你放置时间过长了，像你帖子所说，先 ...

好的，谢谢老师，我近期再试试这个办法。

Shirley2019

也可以考虑使用zombie yellow