PMBC提取的经验及问题讨论

niwanmao

最近又做了一次。情况是这样：两名病人，第一名采血时间大约在6点，取回后水平放置；第二名采血时间在9点40 ...
chujindong 发表于 2011-3-13 22:47

                               
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好，非常欢迎这种实际性操作经验的分享。顶。

sugarswallow

我曾经封过抽血7h后在来分离的，也能分出很清晰的白膜层，肉眼未能看见红细胞的掺杂

chujindong

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实话说，我也有一次分的是放了5个小时的血，分的很好，但也只有这一次放了这么长时间。多数情况下是新鲜血分的好，早上护士抽的血分得不好。

   

chy

可能，在抽血的时候，血和抗凝剂充分混匀还是比较重要的，和水平放置的影响应该不是很大。血中的细胞密度有区分，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（如Ficoll分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。如果和抗凝剂混匀，垂直放置后有分层，可以直接弃掉底层的沉淀，取上层来分离，效果也不错的。

chy

当然，如果条件允许，越新鲜的血样，越早处理，效果肯定是越好的。如果想处理的时间宽裕点，建议自己制备阿氏液（Alsever液）抗凝的瓶子。阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有细胞生存的营养，所以它既可做抗凝剂，又可做血细胞的保存液。

chy

阿氏液（Alsever液），配方如下：
枸橼酸钠（Na3C6H5O7?5H2O） 0.80g
枸橼酸 0.0325g
葡萄糖 2.05g
氯化钠 0.42g
H2O 加至 100.00ml
混匀溶解后，114.3℃高压蒸汽灭菌10min备用。

chujindong

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谢谢分享。我没有试过把血放一天做，可以尝试一下。我采血用的是临床上的采血管，不知是不是用来抽血常规的管子，但确实知道是肝素锂抗凝的。不知道你们做这个实验时是不是用的了下文提到的Alsever液？

   

chujindong

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水平放置的道理我也不是很懂，而且水平放置一段时间后也会分层，只是不太明显。我看到有人用离心后的白膜做PBMC分离，你所说的我也想过，但是因为这样改变了全血的组成比例，我不太清楚稀释到什么程度，分离液需要用多少。不知你有没有经验可以分享一下。

   

chujindong

当然，如果条件允许，越新鲜的血样，越早处理，效果肯定是越好的。如果想处理的时间宽裕点，建议自己制备阿 ...
chy 发表于 2011-3-16 22:19

                               
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我知道说明书上说取到血后用组织培养液稀释一下，可以保证72小时内T细胞B细胞计数值不会变化。还没试过

chujindong

感谢各位战友！目前本人已掌握该技术。
感觉须特别注意以下三点：
1、采血后抗凝一定要充分，不立即处理时可将采血管水平放在摇床上轻摇；
2、所使用的稀释液、淋巴细胞分离液使用前均需充分复温；
3、视情况可将血液稀释倍数加大。
chy战友的意见已考虑，并做了对比观察，发现室温放置12小时确实可以做出来，细胞状态也可以。但由于只有一例对照研究，尚需进一步验证。另外，1640与全血混匀后放置12小时也是可以做出来的。