第一次做组织流式，想请教关于肠道和肝脏的问题

diandianrourou

1.我有一批小鼠样本，想看肝脏里的T和巨噬细胞，但是这一部分肝脏不能全部拿去做流式，我每只最少取样多少能保证顺利完成流式测试。
2.小肠固有层大概能有多少呢，还有PP结和肠系膜呢，看到别人说的，肠道固有层如果操作的好，一只大概分离的量刚好够一次流式测试，真的这么少吗？因此还能不能取出一段做肠道非流式操作了呢。
3.肝脏和肠道固有层能不能不用percoll，加CD45来直接分析。
感谢感谢，实在是拿不准。

niwanmao

小鼠的样本我没做过，没法给你具体的指导。
但是，应该是可以同时做的，只是流式不能做太多管，尽量方案集中到一管里面做。

向前看

小鼠肝脏的淋巴细胞提取特别少，整肝提取的话大概1-5X10^6个，而且操作过程中还会损失一部分。建议用40%/70%percoll进行纯化一遍，否则细胞碎片和干细胞等实质细胞干扰非常大。如果你还要做其他检测，建议流式至少要用2/3的肝组织。我也非常赞同倪老师的建议：尽量方案集中到一管。
至于肠组织的没做过。

yxyyjs

这贴看了我就心痛，很不幸被迫做过小鼠肠固有层淋巴细胞的流式检测，还有心脏和肺组织里的淋巴细胞（肺泡灌洗液里的就好测多了），
这么说吧，为了找到最合适的复合消化的方法，各种酶也都排列组合试过了，然而根本没有拿到所谓的固有层淋巴细胞，不是少到不够检测，而是真的拿不到活细胞啊，死活试剂盒染上去，群里就那么丢丢细胞，几乎全是死的，感觉这类实验的门槛好高
楼主good luck

大品咿呀哟

肠肝我都做，我主要是做小鼠肠道疾病模型的，正常的肠道要预消化+消化，然后再过percoll40/80纯度会高一些，成年鼠的结肠在留取HE和RNA样本后还是可以跑出比较明显的图，细胞量在1-2million，乳鼠的差不多就是2-3个million（乳鼠是小肠）肝脏也是要过percoll的 30/70

Claire-pei

大品咿呀哟 发表于 2020-6-7 21:07
肠肝我都做，我主要是做小鼠肠道疾病模型的，正常的肠道要预消化+消化，然后再过percoll40/80纯度会高一些 ...

请问您有染小鼠肝脏CD4+CD25+FOXP3+吗？percoll分离会有比较明显分群吗？我一直做不出来

杨小怡

大品咿呀哟 发表于 2020-6-7 21:07
肠肝我都做，我主要是做小鼠肠道疾病模型的，正常的肠道要预消化+消化，然后再过percoll40/80纯度会高一些 ...

你好，我最近也在做小鼠肠道固有层的淋巴细胞流式上机，我发现就算是我用了percoll来分层，得到的中间免疫层，染色上机后流式图还是不好看，有很多杂细胞，能不能问一下你们用的是什么酶来消化的呢？

大品咿呀哟

杨小怡 发表于 2022-4-24 13:45
你好，我最近也在做小鼠肠道固有层的淋巴细胞流式上机，我发现就算是我用了percoll来分层，得到的中间免 ...

胶原酶1或4 透明质酸酶

大品咿呀哟

Claire-pei 发表于 2022-4-21 09:24
请问您有染小鼠肝脏CD4+CD25+FOXP3+吗？percoll分离会有比较明显分群吗？我一直做不出来 ...

可以的 没什么问题 可以做个预实验试试 之前有做过 可以分出来 但是我不做T细胞所以那个实验只是验证一下

congou

可以参照这篇文章做，里面有小鼠肝脏免疫细胞的流式。
Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eur J Immunol. 2021;51(12):2708-3145. doi:10.1002/eji.202170126