多色抗体选择方略

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多色流式细胞分析中抗体选择问题（上部）

随着六色、八色或更多色流式细胞仪的出现，新荧光染料和标记抗体也得到了长足发展。然而为实验中所需抗体选择最佳的荧光染料组合是一个复杂的过程。本文将提供了一些简单、实用的方法来帮助您如何选择多色流式细胞仪检测试剂组合，避免重复试验和错误，增加你实验成功的机会。

1，
基础知识：了解您的机器

试剂的选择首选是根据您仪器配置开始的。仪器中所装配的激光器和探测器的型号和数量决定了你的仪器的光学系统能否激发某个荧光染料，并能否正确地检测某个荧光素组合。光学系统的设计还会影响某个特殊染料的检测效率，同样也会影响仪器的设置，包括PMT的电压。（见BD FACSDiva™ ，6.x软件中BD Cytometer Setup and Tracking [CS&T]特性）。最后，每个探测所使用的光学滤镜也会极大的影响某个荧光染料的有效检测强度。滤镜的选择是一个互相妥协的过程：使用一个带宽较大的带通滤镜可以提升对特定荧光染料的检测能力，但是同样也会增加相邻检测通道的荧光染料所带来的渗漏本底。使这些影响可视化一个很好的方法是使用一些网络工具（例如bdbiosciences.com/spectra.光谱检测器）来对滤镜组合进行虚拟测试。这个工具可以图型方式预测某个荧光染料组合与滤镜组合同时工作时所发生的荧光渗漏。

2，
荧光素：追求最佳灵敏度

由于仪器的配置不同，实际中不存在一个固定的六色、八色或更多荧光组合能适用于各种机型。但是，针对某一特定的流式细胞仪（BD™ LSR II）上， 我们可以根据荧光染料在这台仪器（相同的激光和滤镜的设置）上的检测强度来确定荧光素的选择范围。但如何才能正确的定义并测定有效荧光强度呢？一个对染色强度的准确定义需要评估染色过程中的背景信号的强度、阳性信号与未着色信号之间的差异。特定检测器的背景信号是由信号水平、细胞自发荧光、非特异性染色、电子噪音和其他荧光染料渗漏的光学背景等因素造成的。换言之这些因素每个都会增加噪音和/或特异性信号的强度，即它们会增加阴性群体的信号宽度（如图1）。因此，一个标准、有效的衡量试剂染色有效强度的指标---染色指数，可定义为D/W，D为阴性群体与阳性群体间的染色差异，W为阴性群体间标准差的二倍。

当同一种抗体结合了不同的染料，我们就可以通过在同一台仪器上测定不同染料的相对强度来比较它们的染色指数。这里我们假设所有试剂的结合的化学方法都是最优化的。那么在这种假设的前提下, Table 1给出了结合不同荧光素的CD4抗体的染色指数，在标准的BD LSR II细胞仪上使用相同的滤镜。

表格中的信息提供了在完全相同的平台上不同荧光素染色相对强度的对比。这就得出了荧光素选择的第一条原则，选择可用的最亮的荧光素。假设你有一个四色的方案，包括的试剂有FITC, PE, PerCP-Cy™5.5和APC四种颜色，那么如果你想假如第五种颜色，PE-Cy™7是一个明智的选择，因为PE-Cy™7是你已有颜色之外最亮的一个。

...但是要最小的渗漏

就亮度本身而言，讨论的内容已无余地。表1中的染色指数针对单个抗体计算得到的，而不是在一个试剂组合中进行检测得到的。因此，当有其他的试剂加入时，光谱叠加（或称荧光渗漏）的问题就显现出来了。要试图从越多种荧光发射光中独立检测出一种荧光，那么要处理的各颜色间的渗漏也就越多（荧光补偿）。我们通过使用荧光补偿来处理荧光渗漏问题，它能够校准所有类似以下的这种情况：例如，一个细胞群体只发PE的荧光，而没有FITC的荧光。虽然对于群体的平均水平来说是正确的，但是个别细胞的值会低于或高于平均值，此时由于经过的荧光补偿而增加了噪音信号的比重，使用细胞分布更为“宽广”了。荧光补偿虽然可以修正群体的中位值，但由于染色中噪音而导致的数据分布（方差）依然存在，而补偿不能够去除这一噪音。因此，当一个荧光探测器受到其他探测器的渗漏荧光时，分布更为“宽广”数据影响信号的灵敏度，进而降低染色指数。因此，选择荧光素的第二条规则就是，选择试剂组合时要将光谱叠加可能性减到最低。这可以能与第一条选择最亮的荧光素的规则是冲突的。例如，根据染色指数（表1）PE-Cy™5 是很亮的荧光素，但是它的光大部分都渗漏（增加背景荧光）到APC探测器中了。如果这两个荧光素共同使用，那么APC探测器的信噪比就会比APC同PerCP-Cy5.5共同使用时要低得多。这就是一个例子，你需要牺牲某探测器个别的荧光的亮度来避免荧光渗漏（以及敏感度丧失）。

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4. 复合染料：防止降解

最后一个主题是关注偶联抗体的降解问题。当有光、固定液或温度升高的因素存在的情况下，APC-Cy7会小部分降解，PE-Cy7会降解，它们的荧光就会被母荧光素探测器检测(APC 或 PE)。这一过程往往是从某个小亚群的细胞开始的，导致APC或PE中出现假阳性群体。避免样本接触光、热和甲醛固定液的程度减到最低可以很大程度上避免降解问题。另外，BD Biosciences还开发了APC-H7染料，是一种APC-Cy7的类似物，但在光、热和甲醛固定液中的稳定性提高了很多。在一些应用中，仍然有一个额外的规则：考虑到偶联染料有可能被降解，并且可能影响APC和PE的解析敏感度。这样的话，不同的试剂配伍可能会更加适合。如果遇到某些样本必须进行固定的情况（如生物公害），在不影响固定的情况下可以使用一些保护APC-Cy7不被降解的试剂(BD Biosciences Cat. No. 338036)。另外，可以使用一些更为稳定的偶联染料，BD现在提供APC-H7结合的荧光抗体。

5. 应用对照来优化方案

如果以上的所有因素都已经被考虑到了，那么您就可以开始试验你的多色试剂组合了。如果要做，有两组对照试验要包括在您最初的试验里: 精确度对照和荧光扣除对照（FMO）。精确度对照是只使用某个特定抗体（或只加入少量必须的设门抗体），然后与整个试剂套餐一起使用的结果进行对比。这样你就可以看到添加的其他试剂对你目的结果的影响，以确定其他试剂是否对最终结果有影响。FMO对照是指使用整个套餐中除了目的抗体以外的所有试剂来检测。这个对照对检测其他所有试剂对某个探测器敏感度的影响是很有用的。它们对检测这些探测器设门是否可行也很有帮助。但是大体上，一旦一个试剂组合能够正常使用了，那么所有的这些对照都是不需要每天都做的。

综上所述，本文总结了一些多色流式细胞术试剂选择的规则，这些规则需要达到一个平衡仪得到最佳的实验结果:

原则 1: 针对您特定的仪器配置，选择最亮的荧光素。

原则 2: 选则荧光素要尽量降低光谱叠加的可能.

原则 3: 保留最亮的荧光素给弱表达的抗体，反之依然。

原则 4: 要避免把高亮度群体的荧光渗漏到需要保持高敏感性的测试通道中去。

原则 5:尽量避免偶联染料的降解，考虑它是否会影响结果。

随着时间的推移，被验证过的多色试剂组合将越来越多，无论从文献来源或是制造商。许多用户将不必从设计试剂模板开始。不过，考虑到多色流式细胞仪的应用种类繁多，多数研究人员有时会发现自己不得不选择自己特有的多色试剂组合。我们希望这些规则对您是有益的。

（请访问bdbiosciences.com/colors 以得到关于我们多色流式试剂的详细信息。）

6. 多色流式细胞仪试剂

扩展您超越典型五色的多色流式方案

• BD Biosciences一直在发展我们多色产品的种类，以支持您使用我们的流式细胞仪不断扩展的荧光检测能力来完成您的尖端研究。

•我们通过提供紫激光、红激光和蓝激光适用的荧光抗体来超越您典型的五色方案。这些包括 AmCyan, BD Horizon™ V500, BD Horizon™ V450, Alexa Fluor 700,和BD APC-H7结合的荧光抗体，支持一多达9色分析的试剂。

• BD Biosciences的用户定制抗体为您的多色实验设计提供更多的选择。这种用户定制套餐支持多色，见Table 3.

niwanmao

感谢分享，不过似乎有点不全，最后一句话“见table3”，却不见表格。
这篇文章看内容应该是BD的人发的。

haven_t

怎么渗漏这个词听起来怪怪的，虽然有些老外叫spill over，但国内好像没有人会这样说。好像是BD技术部出的一本期刊里面的文章，曾经看过。