新手请教CD8+T细胞圈门问题

Climber

一篇文献提到过在经过CD3 CD28刺激之后需要用培养基将细胞恢复24h之后再进行流式染色。另一方面，CXCR3一般是能分群的，您可能需要根据信噪比来确定最佳的抗体滴度以及PE最合适的电压，信噪比是指阳性细胞群的MFI与对照细胞MFI的比值，一般要大于3。抗体根据使用说明设置高中低三种浓度及同型对照，计算信噪比，确定最佳并且节省的抗体滴度后再进行正式实验。愚见 仅供参考
信源：Barbi, Joseph et al. “T cells from Leishmania major-susceptible BALB/c mice have a defect in efficiently up-regulating CXCR3 upon activation.” Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) vol. 181,7 (2008): 4613-20. doi:10.4049/jimmunol.181.7.4613

niwanmao

面团胖宝宝 发表于 2022-8-3 12:42
倪老师您好，听您的解答更改阈值后有了很大的改善，CCR5能有分群，可是CXCR3还是无法分群只有比例上的变 ...

趋化分子，特别容易受处理条件、固定保存等影响。
逐一排查一下处理过程吧。

面团胖宝宝

Climber 发表于 2022-8-3 15:28
一篇文献提到过在经过CD3 CD28刺激之后需要用培养基将细胞恢复24h之后再进行流式染色。另一方面，CXCR3一般 ...

谢谢解答 我去看一下这篇文献

面团胖宝宝

niwanmao 发表于 2022-8-3 22:06
趋化分子，特别容易受处理条件、固定保存等影响。
逐一排查一下处理过程吧。 ...

这个图是提出了CD8+T细胞之后直接孵抗体上机测的，全程4度离心，管子也一直放在冰上

2315471758

面团胖宝宝 发表于 2022-8-3 12:42
倪老师您好，听您的解答更改阈值后有了很大的改善，CCR5能有分群，可是CXCR3还是无法分群只有比例上的变 ...

会不会是抗体使用浓度过高呀？还是PE信号太强了呢，我也遇到过分不开的，不知道原因

lgbu08696

Biolegend的CCR7趋化因子抗体下面有这么一句话：
Q: Does staining at room temperature or even at 37°C help for checking chemokine receptors expression?
A: Due to continuous recycling of many chemokine receptors, it may be worthwhile to consider staining at room temperature or at 37°C if the staining at lower temperature (which can potentially reduce receptor turnover) is not optimal.
感兴趣的话可以试试室温或者37度孵育抗体（我没试过，感兴趣，期待有人可以试试哈哈）
https://www.biolegend.com/en-us/ ... -ccr7-antibody-7536