PI染色法用于流式细胞仪区分死活细胞配方问题

HYL20180112

大家好，我是想用流式细胞仪区分海水中活细胞和死细胞相对含量，选择PI染色法染色死细胞，SYBR Green I染色DNA。我准备直接取样1ml海水同时添加PI和SYBR Green I染色在不同波长下统计细胞数，现在想问问大家，PI染色剂的配方，网上的配方多种多样，实在无法辨别真假。恳请做过此类实验的老师同学告知具体配方，PI染剂使用液浓度，终浓度和取样1ml海水后的添加量。

HYL20180112

我看到好多网上的配方，包括一些文献中都是配置PI都加了曲拉通Triton X-100，但是也有人说加曲拉通会导致细胞死亡？

niwanmao

因为你是区分死活的，所以不需要加Triton。
PI一般用10ug/ml，取5－10ul加入100ul样本中，染色1分钟即可。

HYL20180112

niwanmao 发表于 2018-1-20 17:25
因为你是区分死活的，所以不需要加Triton。
PI一般用10ug/ml，取5－10ul加入100ul样本中，染色1分钟即可。 ...

老师，请问10ug/ml是指终浓度吗？还是PI工作液浓度，PI是直接用灭菌PBS配制就可以吧

niwanmao

HYL20180112 发表于 2018-1-20 19:18
老师，请问10ug/ml是指终浓度吗？还是PI工作液浓度，PI是直接用灭菌PBS配制就可以吧 ...

工作液浓度。不需要灭菌。

HYL20180112

niwanmao 发表于 2018-1-20 20:29
工作液浓度。不需要灭菌。

好的，知道了，老师，区分死活细菌阀值Thershold是不是设在1700左右？我用的慢速5min。

HYL20180112

HYL20180112 发表于 2018-1-21 08:55
好的，知道了，老师，区分死活细菌阀值Thershold是不是设在1700左右？我用的慢速5min。 ...

1700 on FSC-H

niwanmao

HYL20180112 发表于 2018-1-21 08:55
好的，知道了，老师，区分死活细菌阀值Thershold是不是设在1700左右？我用的慢速5min。 ...

首先，不知道你的机器是什么型号，其次，每台机器的设置可能都不同，所以单纯问我设多少阈值，我回答不出来。

HYL20180112

老师，我用0.22微米的荧光微球测试了，大概在400FSC-H左右。但是PI染色的效果不是很好，我用的PI工作液浓度为100ug/ml，取样1ml，加入10ul工作液染色5min，610/20 BP装载在FL1通道，用的BD Accuri C6，分析数据软件Cflow

HYL20180112

niwanmao 发表于 2018-1-22 14:10
首先，不知道你的机器是什么型号，其次，每台机器的设置可能都不同，所以单纯问我设多少阈值，我回答不出 ...

我的PI是直接用PBS配制的，是不是应该加入RNA酶去除PI染色到RNA的影响？