设计流式方案时最容易犯的错误

niwanmao

高表达的抗原（如CD3）选择弱的荧光素，而目的抗原则选择最强的荧光素，这个原则以前的流式方案设计时是关键性的，也是比较容易确定的原则，因为以前的仪器性能以及可用的荧光素很有限。但随着仪器性能的提高，可以检测越来越多的荧光素（4色以上），染料技术也得到了很大的发展，现在需要的是确定不同的荧光素标记抗体在实际实验条件下结合细胞后的相对亮度，而不是根据荧光素本身判断。


Bigos等人在2004年首次以摘要形式报道了此研究，后来Maecker等人进行了简化。图1所示的公式就是两人研究结果，其计算的是阳性峰和阴性峰之间的平均荧光强度差值，再除以阴性细胞群的标准差（即阴性峰的分散程度）。这个结果就叫染色指数（Staining Index，SI），它能比较荧光素的相对亮度。

图1

而如图2所示，如果不同荧光素结合到同一种抗原上，然后标记细胞，就可以比较不同抗体之间的染色指数（SI）。研究人员如果没有把SI值考虑进去，那么就会在设计流式实验方案时犯很大的错误。

图2

图2的计算结果显示PE > APC > FITC > PerCP，因此，给研究人员设计多色方案提供了关键性的信息。


不过SI还是有一些不足之处，最显著的不足就是其数据容易被噪音的标准差所影响，因为阴性峰至少有一部分是仪器电路产生的背景噪音信号。所以Telford等人在2009年对SI的公式进行了修正，这个公式的计算过程如下图：

图3

于是修正后的SI为了与原来的染色指数区分，改称为分离指数（Separation Index）。
原文：Separation Index: An Easy-to-Use Metric for Evaluation of Different Configurations on the Same Flow Cytometer
免费在线阅读：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzQ5MHxiZGVmYjY2OHwxNzMyMjc4ODg5fDB8
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2015-1-26 16:16 上传

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在下图可以看出，分离指数和染色指数还是比较一致的：

图4

不管是染色指数还是分离指数，都是非常重要的实验参数，需要多加注意。

EthanMr

倪老师，这两个表的染色指数好像差别很大呢，尤其是APC（第一个表279.2，第二个表48.02），是机器不同造成的吗？

niwanmao

EthanMr 发表于 2015-1-30 09:56
倪老师，这两个表的染色指数好像差别很大呢，尤其是APC（第一个表279.2，第二个表48.02），是机器不同造成 ...

抗体不同，同种荧光素当然会不一样：）

EthanMr

niwanmao 发表于 2015-1-30 10:44
抗体不同，同种荧光素当然会不一样：）

哦，明白，我竟然把抗体的问题给忽略了。这样来看的话，染色指数跟抗原表达的强弱是否也有很大关系？是否对于弱表达的抗原，检测到的信号相对要弱，其染色指数相对也会小一些？

爱白衣杀手

@niwanmao@EthanMr  同问。之前一直以为APC比FITC荧光强要用在若表达抗原上，现在看来FITC比APC更适合若表达抗原，按文意是这个意思吗？

niwanmao

爱白衣杀手 发表于 2015-2-3 15:35
@niwanmao@EthanMr  同问。之前一直以为APC比FITC荧光强要用在若表达抗原上，现在看来FITC比APC更适合若表 ...

不是，原来那个原则还有一定的效用，但是，因为现在荧光素数量的增多，所以更多的是依靠分离指数来确定哪个荧光素更适合哪种抗体。