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认识一下染色指数吧,它会帮助你把流式做得更好

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发表于 2015-7-13 20:14:42 | 显示全部楼层 |阅读模式

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我们需要感谢最近若干年荧光染料技术的进展,让我们在流式抗体搭配时有了更多的荧光染料选择,为多色流式的发展提供了强有力的工具,为复杂细胞群的分析提供了可能。但同时带来的问题是,我们如何选择荧光染料呢?PE还还是APC好呢?下面我们来认识一下我们的帮手——染色指数(Staining Index,SI),它能可靠地衡量阳性群和阴性群之间的分离程度。计算方法如下图:
StainIndex1.jpg




如果另一个荧光素阳性细胞群的平均荧光强度(MFI)更低,那么SI也会降低,见下面的动图(随着阳性群的左移,SI也会降低):
Pos_MFI.gif


还有,如果另一个荧光素产生的阳性细胞群MFI一样,但是阴性群的基底更宽,即意味着变异系数更大(即使阴性细胞群的MFI也是一样的),那么其SI也会降低,见下面的动图(随着阴性群SD增大,SI降低):
Neg_MFI.gif



所以,同一克隆的抗体,不同荧光之间比较亮度,可利用SI进行比较。如下图,是BioLgend利用BD LSR II Fortessa™比较同一克隆CD8的三种荧光素排行:
StainChart.jpg



但不同的荧光素亮度还会受到以下因素的影响,例如:
1. 抗体克隆和抗体质量。
2. 荧光素纯度和质量。
3. 荧光素和蛋白比例(f:p比例)。
4. 激光和激光器功率。
5. 使用的长通和带通滤光片。
6. 使用的目的细胞。

因此,我们对于不同公司、不同克隆的抗体,即使用了同样的荧光素,也要用SI进行重新评估,而不是根据现成的排行榜单,因为影响因素很多。不过,由于有了SI这个好帮手,所以,我们也不怕抗体荧光素的亮度问题了,并且SI可帮助我们进行抗体滴定,确定某个批号抗体最佳使用浓度。


编译自Biolegend。
发表于 2015-7-15 10:33:02 | 显示全部楼层
。感谢倪老师的资料。
要想设计最优化的多色方案,仔细参考SI进行选择是必经的一步。它综合反应了所用仪器的性能、实验操作、荧光抗体、细胞抗原这些全部的、所有环节的影响,是最实用的直接衡量最终结果的指标。
发表于 2015-7-15 11:15:07 | 显示全部楼层
原理明白了,实际操作中要怎么比较呢?有什么软件吗?
发表于 2015-7-15 16:28:57 | 显示全部楼层
tianpaopao 发表于 2015-7-15 11:15
原理明白了,实际操作中要怎么比较呢?有什么软件吗?

其实这些都是荧光素自身特点,不用自己去测定。你只要在配色的时候注意一下,把低表达的指标配上染色指数高的荧光素,高表达的指标配上染色指数相对较低的。我们实验室有一张染色指数排序的挂图,是BD公司给的,你可以向他们销售要一张挂实验室里,配色的时候拿不准可以查一下
 楼主| 发表于 2015-7-15 16:46:46 | 显示全部楼层
tianpaopao 发表于 2015-7-15 11:15
原理明白了,实际操作中要怎么比较呢?有什么软件吗?

计算染色指数的话,目前似乎只能手工计算。
发表于 2015-7-16 10:11:02 | 显示全部楼层
小憨 发表于 2015-7-15 16:28
其实这些都是荧光素自身特点,不用自己去测定。你只要在配色的时候注意一下,把低表达的指标配上染色指数 ...

好的,谢谢哦~~
发表于 2015-7-16 16:03:06 | 显示全部楼层
受用,太好了,写的
发表于 2015-7-24 21:40:56 | 显示全部楼层
对于分群不明显的,比如测定细胞因子的时候也可以用吗?
 楼主| 发表于 2015-7-25 21:24:51 | 显示全部楼层
77609439 发表于 2015-7-24 21:40
对于分群不明显的,比如测定细胞因子的时候也可以用吗?

细胞因子胞内染色,并且有些细胞因子分群不好,此时建议按照推荐的量来吧
发表于 2018-2-6 10:03:52 | 显示全部楼层
我查到有些说染色指数stain index=D/W,不明白D是两个峰中心间的距离,这两个峰是阳性峰与阴性峰的距离还是发射峰与激发峰的距离,另外W是阴性峰/发射峰的半峰宽吗,与SD有什么数值上的关系呢,谢谢
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