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刺激T细胞的佛波酯(PMA)为什么会导致CD4下调?

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发表于 2015-10-21 20:17:39 | 显示全部楼层 |阅读模式

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流式中文网论坛中,经常会出现一些很好的问题,所以,这就是为什么思想的碰撞会擦出火花。

今天就一起结合文献聊聊佛波酯(PMA)导致CD4表达下调的问题,“@弥勒 ”站友一言问出了根本(见下图),估计都没考虑过PMA导致CD4表达下调的机制吧。

弥勒
倪老师,您好!
      做人Th17的流式检测时,用PMA刺激4小时候,会导致CD4分子的内吞,这个有没有相关文献报道呢?具体原理是什么?假如同时做Th17和Treg,能否先表面染色CD4和CD25,然后再刺激后,染Th17和Foxp3呢,这样能否避免CD4分子的内吞,期待您的回复。

实际上,这个我们习以为常的现象在1990年已经有学者研究过了(Michael Bigby.  PHORBOL MYRISTATE ACETATE-INDUCED DOWN-MODULATION OF CD4 IS DEPENDENT ON CALMODULINAND INTRACELLULAR CALCIUM. The Journal of Immunlogy, 1990,144:3111-3116 )。

文中首先研究了6种细胞的CD4表达以及5ng/ml~500ng/ml PMA对这些细胞CD4的影响,发现Sub T1、MOLT-3、人外周淋巴细胞、小鼠胸腺细胞、AKR 1G1这五种细胞CD4表达均明显下调,但小鼠外周T细胞影响不明显。(见下图)
屏幕快照 2015-10-21 下午7.53.20.jpg

接着,作者尝试用蛋白酶C抑制剂H-7阻滞CD4的内吞,但H-7只能阻止CD4的磷酸化,却不能阻滞内吞。
继续用钙调蛋白抑制剂W-7或三氟拉嗪,发现这两者在25μM的终浓度能有效抑制CD4内吞,说明钙离子在其中起了重要作用。如下图。

屏幕快照 2015-10-21 下午8.03.44.jpg

那么究竟是胞内钙离子还是胞外钙离子起着关键性作用呢?作者分别用了两种钙离子螯合剂来测试:
EGTA-可螯合胞外钙离子;
QUIN-2 AM-可结合胞内钙离子。
结果如下图,很明显,经过QUIN-2处理的细胞,缺少了胞内钙离子,PMA的处理对其CD4表达没有影响。
屏幕快照 2015-10-21 下午8.05.42.jpg


因此,对于需要使用PMA刺激T细胞,但又需要用CD4检测T细胞的FLOWER们,现在了解了PMA导致CD4内吞的原理之后,你是不是心里有解决方法了呢?
其实,从我个人来看,解决方案从优到劣排序如下:

1、首选固定、破膜,检测胞内CD4,因为大多数FLOWER检测的T细胞指标均包括胞内或核内抗原(例如IL-17、foxP3等),所以CD4和这些抗体一起加不会影响丝毫。
2、如果没做胞内指标,并且 不想做固定破膜,可以考虑用QUIN-2 AM阻止CD4下调,但因为该试剂是钙离子螯合剂,你需要首先确保它不会影响其它指标。
3、先标CD4,然后再进行PMA刺激,这个测出来的可能性不大,并且可能会影响细胞活力。

FLOWER们,你们看了之后还想到其它什么办法吗?欢迎在论坛回帖或直接在微信公众平台回复分享吧。
在此附上原文,点击下面的图标在线阅读,无需下载,支持划词翻译:
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=ODk1MXwzNmFmYmE0MHwxNzExNjUwNjc1fDB8

组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2019-4-8 12:08:08 | 显示全部楼层
mandy 发表于 2019-4-7 08:59
倪老师,那么请问第一种方案的话,在固定破膜前是否需要染表面的CD4,然后固定破膜后再染一次胞内的CD4呢? ...

固定、破膜后,染的CD4,既包括表面,又包括胞内
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发表于 2019-4-7 08:59:30 | 显示全部楼层
倪老师,那么请问第一种方案的话,在固定破膜前是否需要染表面的CD4,然后固定破膜后再染一次胞内的CD4呢?还是说可以认为大部分CD4内吞了,只染胞内的CD4就可以?
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发表于 2015-11-17 14:47:11 | 显示全部楼层
倪老师,如果是检测DC和T细胞共培养上清中IL-17的表达,还需要佛波酯和离子霉素刺激吗?
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 楼主| 发表于 2015-11-17 18:25:19 | 显示全部楼层
zy21318302 发表于 2015-11-17 14:47
倪老师,如果是检测DC和T细胞共培养上清中IL-17的表达,还需要佛波酯和离子霉素刺激吗? ...

一般加细胞因子,不加PMA和离子霉素。
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发表于 2015-11-18 15:09:36 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2015-11-17 18:25
一般加细胞因子,不加PMA和离子霉素。

是加IL-2就可以了吗?
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 楼主| 发表于 2015-11-18 17:14:01 | 显示全部楼层
zy21318302 发表于 2015-11-18 15:09
是加IL-2就可以了吗?

一般是,但是也要看你的实验目的和设计而定。
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发表于 2019-12-19 19:08:17 | 显示全部楼层
倪老师,我用PMA刺激小鼠脾脏单细胞会使mCD3也不分群,还有mCD45会拉的很长,这是怎么回事呢?
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 楼主| 发表于 2019-12-19 20:15:10 | 显示全部楼层
xuexi-ing 发表于 2019-12-19 19:08
倪老师,我用PMA刺激小鼠脾脏单细胞会使mCD3也不分群,还有mCD45会拉的很长,这是怎么回事呢? ...

两个可能性:
1、之前细胞活力就不好。
2、刺激时间过长或刺激剂浓度过大,导致细胞活力差。
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发表于 2019-12-21 18:31:47 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-12-19 20:15
两个可能性:
1、之前细胞活力就不好。
2、刺激时间过长或刺激剂浓度过大,导致细胞活力差。

因组织标本的缘故,表面标记想多染一个CD45和CD3,可否固定、破膜后一起染?换言之,能否固定、破膜后再染各种表面/胞内标记物?谢谢老师!
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