刺激T细胞的佛波酯（PMA）为什么会导致CD4下调？

niwanmao

流式中文网论坛中，经常会出现一些很好的问题，所以，这就是为什么思想的碰撞会擦出火花。

今天就一起结合文献聊聊佛波酯（PMA）导致CD4表达下调的问题，“@弥勒 ”站友一言问出了根本（见下图），估计都没考虑过PMA导致CD4表达下调的机制吧。

弥勒
倪老师，您好！
      做人Th17的流式检测时，用PMA刺激4小时候，会导致CD4分子的内吞，这个有没有相关文献报道呢？具体原理是什么？假如同时做Th17和Treg，能否先表面染色CD4和CD25，然后再刺激后，染Th17和Foxp3呢，这样能否避免CD4分子的内吞，期待您的回复。

实际上，这个我们习以为常的现象在1990年已经有学者研究过了（Michael Bigby.  PHORBOL MYRISTATE ACETATE-INDUCED DOWN-MODULATION OF CD4 IS DEPENDENT ON CALMODULINAND INTRACELLULAR CALCIUM. The Journal of Immunlogy, 1990,144:3111-3116 ）。

文中首先研究了6种细胞的CD4表达以及5ng/ml～500ng/ml PMA对这些细胞CD4的影响，发现Sub T1、MOLT－3、人外周淋巴细胞、小鼠胸腺细胞、AKR 1G1这五种细胞CD4表达均明显下调，但小鼠外周T细胞影响不明显。（见下图）


接着，作者尝试用蛋白酶C抑制剂H-7阻滞CD4的内吞，但H-7只能阻止CD4的磷酸化，却不能阻滞内吞。
继续用钙调蛋白抑制剂W-7或三氟拉嗪，发现这两者在25μM的终浓度能有效抑制CD4内吞，说明钙离子在其中起了重要作用。如下图。



那么究竟是胞内钙离子还是胞外钙离子起着关键性作用呢？作者分别用了两种钙离子螯合剂来测试：
EGTA－可螯合胞外钙离子；
QUIN-2 AM－可结合胞内钙离子。
结果如下图，很明显，经过QUIN-2处理的细胞，缺少了胞内钙离子，PMA的处理对其CD4表达没有影响。



因此，对于需要使用PMA刺激T细胞，但又需要用CD4检测T细胞的FLOWER们，现在了解了PMA导致CD4内吞的原理之后，你是不是心里有解决方法了呢？
其实，从我个人来看，解决方案从优到劣排序如下：

1、首选固定、破膜，检测胞内CD4，因为大多数FLOWER检测的T细胞指标均包括胞内或核内抗原（例如IL-17、foxP3等），所以CD4和这些抗体一起加不会影响丝毫。
2、如果没做胞内指标，并且 不想做固定破膜，可以考虑用QUIN-2 AM阻止CD4下调，但因为该试剂是钙离子螯合剂，你需要首先确保它不会影响其它指标。
3、先标CD4，然后再进行PMA刺激，这个测出来的可能性不大，并且可能会影响细胞活力。

FLOWER们，你们看了之后还想到其它什么办法吗？欢迎在论坛回帖或直接在微信公众平台回复分享吧。
在此附上原文，点击下面的图标在线阅读，无需下载，支持划词翻译：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=ODk1MXw0OWI4NjdlY3wxNzMyMzg2MDM5fDB8

niwanmao

mandy 发表于 2019-4-7 08:59
倪老师，那么请问第一种方案的话，在固定破膜前是否需要染表面的CD4,然后固定破膜后再染一次胞内的CD4呢？ ...

固定、破膜后，染的CD4，既包括表面，又包括胞内

mandy

倪老师，那么请问第一种方案的话，在固定破膜前是否需要染表面的CD4,然后固定破膜后再染一次胞内的CD4呢？还是说可以认为大部分CD4内吞了，只染胞内的CD4就可以？

zy21318302

倪老师，如果是检测DC和T细胞共培养上清中IL-17的表达，还需要佛波酯和离子霉素刺激吗？

niwanmao

zy21318302 发表于 2015-11-17 14:47
倪老师，如果是检测DC和T细胞共培养上清中IL-17的表达，还需要佛波酯和离子霉素刺激吗？ ...

一般加细胞因子，不加PMA和离子霉素。

zy21318302

niwanmao 发表于 2015-11-17 18:25
一般加细胞因子，不加PMA和离子霉素。

是加IL-2就可以了吗？

niwanmao

zy21318302 发表于 2015-11-18 15:09
是加IL-2就可以了吗？

一般是，但是也要看你的实验目的和设计而定。

xuexi-ing

倪老师，我用PMA刺激小鼠脾脏单细胞会使mCD3也不分群，还有mCD45会拉的很长，这是怎么回事呢？

niwanmao

xuexi-ing 发表于 2019-12-19 19:08
倪老师，我用PMA刺激小鼠脾脏单细胞会使mCD3也不分群，还有mCD45会拉的很长，这是怎么回事呢？ ...

两个可能性：
1、之前细胞活力就不好。
2、刺激时间过长或刺激剂浓度过大，导致细胞活力差。

despacito

niwanmao 发表于 2019-12-19 20:15
两个可能性：
1、之前细胞活力就不好。
2、刺激时间过长或刺激剂浓度过大，导致细胞活力差。

因组织标本的缘故，表面标记想多染一个CD45和CD3，可否固定、破膜后一起染？换言之，能否固定、破膜后再染各种表面/胞内标记物？谢谢老师！