如何最有效、最经济地进行阵发性睡眠性血红蛋白尿检测？

niwanmao

阵发性睡眠性血红蛋白尿，简称PNH，有些童鞋可能听说过，有些可能没有听说过，在MDS、再障等病人属于必查项目。项目在不少单位开展了，用的是CD55、CD59，或者上据说更敏感的FLAER。但是，如何做得准确又灵敏，而且还节省抗体，可能少有人去研究。


同为发展中国家的巴西，前几年出过4色免疫分型方案，今年Rodolfo Patussi Correia等人写了篇《Technical advances in flow cytometry-based diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria》（http://ref.scielo.org/vvn8sj），描述了他们摸索条件的经历，红细胞的PNH克隆2色不变，粒细胞的PNH克隆分析从2色到4色再到5色，并统计了一下变化前后的成本，尽管杂志Einstein (São Paulo)没听说过，但是很实在，值得我们学习。


看文章，我习惯直接抓重点，这样效率高，以后回去看可以马上看到关键。


1、最开始的方案咱们跳过，直接看第一次优化的2色红细胞方案和4色粒细胞、单核细胞方案。这里，红细胞还是用CD59更好，CD55被弃去，粒细胞和单核细胞用了FLAER作为指标，粒细胞用CD15和CD24，单核细胞用CD64和CD14。


2、染色步骤，细胞计数后：
红细胞用PBS100倍稀释后，取50ul染色，PBS洗涤两次，上机。
粒细胞和单核细胞均取200ul样本标记，然后氯化铵裂解液裂解，洗涤两次，上机。


3、红细胞的PNH分析。讲解一下图形设门：
Time参数图选择液流稳定区域——FSC/SSC Log图上选择红细胞区域——选择CD235a阳性的红细胞——看CD235a/CD59散点图PNH克隆，这里可见到明显的CD59部分缺失（II类细胞）、CD59完全缺失（III类细胞）。
第五个图是密度，可以更清晰地看出三类细胞分群。
第六个是直方图，比较容易让别人理解，但是分析比例，我个人还是建议用前面散点图形式。
第七、八、九三个图是另一个病人，II类细胞和III类细胞比例很低，属于微量克隆，均<1%，但是还是需要报，不能以以前所谓的95%以上就算正常为标准了，那是旧时代。


4、粒细胞和单核细胞的分析。
A、B分别排除碎片和选择CD45+的白细胞。
C图通过CD15选择粒细胞，然后看D图上CD24和FLAER均缺失的PNH克隆，E图是另一个病人，微量克隆（0.45%），前面说过，不能以以前所谓的95%以上就算正常为标准了，只要细胞获取的多，微量克隆可信，就得报。
F图是单核细胞分析，通过CD64高表达选择单核细胞，然后看G图CD14和FLAER同时缺失的PNH克隆，H图也一样，是微量克隆（0.98%）。



5、红细胞的2色方案足够了，但是对于白细胞，作者发现用两管还是太费抗体，于是继续结合文献开始改良，发现文献报道CD157敏感性更高，于是改成下面的CD45、CD15、CD64、CD157、FLAER  5色方案。


6、新方案当然要和旧方案进行对比了，对比下来，发现完全一致。



7、那么5色方案怎么分析呢？也很简单，首先也是通过排除碎片、选择CD45+白细胞，接着同样是用CD15选择粒细胞、CD64选择单核细胞。两类细胞圈好之后，如下面这样分析两类细胞的CD157/FLAER。
A、B、C、D均可见一类PNH克隆（完全缺失的），其中B和D分别是微量PNH克隆的粒细胞和单核细胞。
E和F演示的是一个存在II类粒细胞和III类粒细胞的病人，可见CD157和FLAER分群一致，结果就靠谱了。
G、H、I、J则是用淋巴细胞作为内部阴性质控，由于圈门时有少量单核细胞圈进去，所以H和I出现少量阳性细胞。



8、最后，作者就粒细胞、单核细胞从2色到4色、5色改良过程的成本进行了计算，发现5色方案的成本只有2色方案的一半，比4色方案还要降低一些。


这么看下来，你们对于PNH的检测组合、设门方案都有数了吗？

这个方案是实现PNH检测标准化、灵敏化的必要方案。

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程小贼的陈大人

好文，学习啦！