同型对照荧光比抗体强，咋办？阻断！

niwanmao

在各种流式细胞术检测中，正确区分阳性和阴性十分重要。要实现阳性细胞群的良好区分，首先要滴定抗体，选择既有高噪比又有低背景荧光信号的用量。
那么，背景信号都是哪里来的呢？仪器的电子噪音、细胞自发荧光、多色流式时通道之间的荧光渗漏，以及抗体的非特异性结合。前三种背景荧光无法完全避免，可以在事后方便得通过一些方式消除，但单克隆抗体非特异性结合到白细胞的Fc受体，就需要事先就做好工作了。


抗体的非特异性结合究竟指的是什么呢？
我们应该了解，白细胞（除了T细胞）表面大多表达CD16、CD32、CD64等Fc受体，这些受体可与各种抗体的Fc端结合，所以会出现非特异性荧光。其中以单核细胞、巨噬细胞尤甚。
如果不对这些细胞的Fc受体进行阻滞，你的实验结果就可能会出现假阳性或者奇怪的结果（也就是很多人在流式中文网论坛www.flowcyto.cn上提问过的同型对照比抗体荧光强）。
在过去几十年，同型对照被广泛用于反映非特异性结合背景，这是基于假设同型对照和抗体完全同源、同荧光、荧光素/蛋白比例相同。但实际上很难找。目前，同型对照的价值受到了很多人的质疑，有人认为，使用Fc阻断，就可以消除非特异性结合，也就是说能够完全取代同型对照。

来看看下面的对比图，你就能了解Fc受体阻断的重要性了。

图1、空白标本，就是未染色，也未进行Fc受体阻断。选择的是CD45＋的白细胞，并且排除了死细胞和粘连体。各通道荧光均低水平。



图2、分别标记IgG1 Alexa Fluor647、IgG2a FITC、IgG2b PE三种同型对照，选择的同样是CD45＋的白细胞，并且排除了死细胞和粘连体。可见其中一类细胞IgG1和IgG2a背景荧光特别强，反设门发现，这类细胞主要是CD14＋的单核细胞。而有意思的是，IgG2b同型对照则背景荧光低很多。



同3、使用100ug/ml人IgG阻断后，别标记IgG1 Alexa Fluor647、IgG2a FITC、IgG2b PE三种同型对照，选择的同样是CD45＋的白细胞，并且排除了死细胞和粘连体。此时，背景荧光恢复到与空白标本相似的水平。



现在明白了Fc受体阻断的重要性了，那么我应该怎么操作呢？方法其实很多，Morten N. Andersen在Cytometry A 2016年9月发表的《Elimination of Erroneous Results in Flow Cytometry Caused by Antibody Binding to Fc Receptors on Human Monocytes and Macrophages》一文中已经帮我们做了大量测试（如下图），从测试结果看，T、B、NK细胞阻断前后背景荧光变化不大，说明不进行阻断也没关系，但单核细胞就必须进行Fc阻断，结果理想的Fc阻断试剂有：

（1）商品化的Fc Block（25ug/ml或10ug/ml）；
（2）2.5％或10%的人血清或小鼠血清；
（3）100ug/ml的人IgG。

看到最后，你可以在想，哎呀，还要订阻断剂，多花钱了。如果不想阻断，又想获得好结果，那么就选择抗体的时候避免IgG1亚型和IgG2a亚型的，尽量找IgG2b亚型的抗体。如果找不到，那就没办法，你必须要买前述的阻断剂了。

原文请点击下列图标在线阅读，支持划词翻译：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTE0NTJ8YzFhMDU0MDB8MTczNTE3NDEwM3wwfA%3D%3D
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圈圈O2

老师你讲的好好！我实验就是又用阻断剂又做同型对照，之前一直不明白，看了你的文章恍然大悟。因为我的细胞是单核白血病细胞，染色抗体又用的IgG1。谢谢老师~

niwanmao

jiangmeng 发表于 2016-12-1 18:54
好的，谢谢您。还有一个问题，我看到许多好杂志的文章大部分都是用的同型对照作为设门的依据，做了同型对 ...

这两种概念站内以前发过不少帖子，在此不再详述，可自行搜索。

特勒兮兮

那么是淋巴细胞都不需要经过阻断吗？

niwanmao

特勒兮兮 发表于 2016-11-17 14:36
那么是淋巴细胞都不需要经过阻断吗？

淋巴细胞还好

jiangmeng

niwanmao 发表于 2016-11-17 15:17
淋巴细胞还好

老师你好，我如果做全骨髓细胞和外周血细胞呢，需要阻断吗？
还有使用阻断剂后是不是就不需要做同型对照了？

niwanmao

jiangmeng 发表于 2016-12-1 09:21
老师你好，我如果做全骨髓细胞和外周血细胞呢，需要阻断吗？
还有使用阻断剂后是不是就不需要做同型对照 ...

看你要分析什么群体，阻断后理论上可以不用同型对照。

jiangmeng

niwanmao 发表于 2016-12-1 11:19
看你要分析什么群体，阻断后理论上可以不用同型对照。

好的，谢谢您。还有一个问题，我看到许多好杂志的文章大部分都是用的同型对照作为设门的依据，做了同型对照还需要进行FMO（好像看到做这个文章不多）吗？

jiangmeng

niwanmao 发表于 2016-12-1 11:19
看你要分析什么群体，阻断后理论上可以不用同型对照。

我主要分析的相关的抗体是 lineage， CD34， SCA-1， C-kit， PECAM， CD133 等抗原。  阻断的话使用   Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) 这个可以吗？用FBS是不是效果不是特别好？

niwanmao

jiangmeng 发表于 2016-12-19 03:24
我主要分析的相关的抗体是 lineage， CD34， SCA-1， C-kit， PECAM， CD133 等抗原。  阻断的话使用   P ...

可以。效果肯定是Fc Block好。

972676742

niwanmao 发表于 2016-12-19 08:15
可以。效果肯定是Fc Block好。

倪老师，这个数据的文献能分享吗？