关于流式直方图的问题

steven

大家好，今天有一个关于直方图的问题想请教大家。
如图所示，这是一个FITC的直方图。
第一张是同型对照组，只加了FITC的第二抗体。
第二张图是GAFP的第一抗体和FITC的第二抗体。
第三张图是ALB的第一抗体和FITC的第二抗体。
那么用现有的图能判断GAFP和ALB的表达情况吗？原来有老师告诉我，P3之后的就是阳性比例，比如说第二张图，P3区域内的就是GAFP阳性细胞，P3之前的就是非阳性细胞。但是最近看书，书上说像这种直方图，很标准的正态分布的话，整个正态分布的区域都是一种细胞。比如说第二图，尽管P3之前的荧光强度和对照组有交叉，但整体的强度是大于对照组的，所以图二中的所有细胞都应该是GAFP阳性细胞。哪种说法是正确的呢？
另外，虽然图二和图三是两种不同抗体，但是FITC用的是同一种二抗，如果阳性的话，荧光强度不应该是相同的吗，为什么图三的整体荧光强度还是要比图二高一些？
最后一个问题，如果确定检测的细胞中有阳性细胞也有非阳性细胞，那么直方图的话是不是应该有两个峰，如果像图上表示的只有一个峰，是不是说明只有一种细胞？
希望大家帮我解答。

niwanmao

steven 发表于 2017-4-26 09:41
谢谢老师回复并且提供论文。
那么不能分群的原因可能是什么呢？为什么没能出现两个峰呢？
另外画门的话， ...

不分群原因就是这个抗原的表达量不够多，从统计学上无法与阴性细胞群分开。
例如阳性细胞表达的分子个数50－100个，阴性细胞表达的分子个数0～70个，所以就无法分开。


设门的话，用散点图设门会容易一些。

niwanmao

你的同型对照组不对吧，应该加与GAFP或ALB相同亚型的同型对照一抗，然后再加FITC二抗才对。而且，建议在分析这类细胞之前，最好先进行排除碎片、排除粘连体、排除死细胞等设门，以免非特异性荧光干扰过大。

steven

niwanmao 发表于 2017-4-19 20:06
你的同型对照组不对吧，应该加与GAFP或ALB相同亚型的同型对照一抗，然后再加FITC二抗才对。而且，建议在分 ...

谢谢老师指导。
这些细胞都是经过破膜处理的死细胞，比如说假设现在同型对照组是正确的，这个图应该怎么看呢？是P3之后的是阳性的，还是整个区域都是阳性的？如果只有一个峰，是不是代表只有一种细胞啊？
再请教一下同型对照的问题，比如说检测Rat细胞，用Rabbit的一抗，再用含FITC二抗，那么同型对照组必须用Rabbit的非特异性一抗和含FITC二抗对比吗？可以直接用偶联了FITC的抗Rat非特异性抗体做比较吗？

小憨

第一个问题，我觉得这样理解你看行不行。关于阳性细胞，主要看你把阈值画在哪个位置，超过这个阈值可以定为“阳性”，否则为阴性。置于你这几个样品，每个样品都是有一群细胞组成的，实际上几个细胞群体，你用流式细胞仪吸取一些做检测，其实是进行了一次抽样，抽取的样品是可以计算平均值（平均荧光强度）和标准差（从CV值）的，也就是说是可以采用T检验去分析这两个细胞群是否是两个不一样的群体，而不是抽样造成的差异。所以你后面说的“阳性”是指的样品（细胞群）区别对照样品的差异。
第二个问题，因为你一抗用的不一样啊，一抗结合有多有少，这种差异又被二抗放大了，就更不一样啊。要是按照你的说法，那所有样品不管是对照还是实验组，只要用同样的二抗，那岂不是都没差异了。
第三个问题，这还是统计上的一个问题，你把荧光强度当成连续变量还是分类变量。如果两群细胞荧光强度差异特别大，那可以把一群定义为阳性另一群为阴性；那如果差异不是很大，一群比另一群高一些，用荧光强度作为连续变量进行统计是比较合适的。

steven

小憨 发表于 2017-4-20 17:57
第一个问题，我觉得这样理解你看行不行。关于阳性细胞，主要看你把阈值画在哪个位置，超过这个阈值可以定为 ...

谢谢您的细心回答。关于第二个问题我已经明白了，就是一抗抗原表达量不同造成的荧光强度差异，但是第一个和第三个问题还是有点不明白。
第一个问题划阈值，就像我图中展示的，第一张图最强荧光之后划为P3，则第二张图中P3范围内就存在了一些细胞，我原来以为P3区域内的细胞就是阳性细胞，因为只有P3区域内的细胞荧光强度才全比对照组强。但是最近看书，书上说像这种标准的正态分布图中的细胞，抗原表达量是一样的，也就是说图二中整群细胞都是表达该抗原的细胞，即全是阳性细胞，而不仅仅是P3区域内的才是阳性细胞。为了大家能看明白，我把书上这部分拍了照片上传。
如果图二有两个峰，一个是和对照组位置一致的峰，另一个是比对照组强度高的峰，那么很容易就能理解肯定是强度高的这部分是阳性细胞，但是现在只有一个峰，并且强度和对照组有重叠，就不知道怎么比较了。因为想分析细胞的纯度，需要知道阳性细胞所占的比例，所以想弄明白到底应该怎么比？另外说一下，因为自己知道肯定这组细胞不是100%阳性的细胞，为啥只有一个峰而没有出现两个峰呢？

小憨

你觉得这两种细胞（红和黑）是一种细胞吗？哪个是阳性？

steven

小憨 发表于 2017-4-23 17:21
你觉得这两种细胞（红和黑）是一种细胞吗？哪个是阳性？

你好，没有太看懂你的意思，你是说在相同条件下如果2份样本分别出现这样的图形哪个是阳性吗？我觉得没法判断。
上次我提出的问题如果方便可以帮我解答一下吗？

steven

@niwanmao 倪老师 如果有时间可以再帮我解答一下问题吗，或者指点一下如果想用MARKER测定细胞的纯度应该采取什么方法呢？

niwanmao

steven 发表于 2017-4-24 10:20
@niwanmao 倪老师 如果有时间可以再帮我解答一下问题吗，或者指点一下如果想用MARKER测定细胞的纯度应该采 ...

测细胞的纯度就是用特异性的标记。你这个问题里面的目的我到现在也没搞清楚，如果你要测的这两个如此弱表达的，那么我觉得是无法测出细胞纯度的。一定要像CD3那样分得清楚才比较好。