首次发现：两个不相干的染料（FITC和Krome Orange）竟然出现补偿，原因已查明

niwanmao

同时检测多种荧光染料标记的免疫标记是流式细胞仪的一个特殊特征。在大多数现代细胞仪中，蓝色 (B，488 nm)、紫色 (V，405 nm)、红色 (R，630 nm) 激光器依次激发荧光染料，并在不同光路上检测到的发射光。

然而，一些荧光染料（受体）也可以被另一种被称为荧光共振能量转移 (FRET) 的形式激发。然而，一般情况下，FRET发生的概率几乎为零，除非两种荧光染料的距离与Förster公式描述的临界距离（低于10 nm）相当，并且供体发射光谱与受体激发光谱重叠。

FRET通常是串联染料的基础原理，使得用一个单一光源检测多种颜色成为可能。但是能够作用FRET「供体」的荧光染料屈指可数，主要为PE、PerCP、APC等，而其他荧光染料如Texas Red(625 nm)、Cy5(660–675 nm)、Alexa Fluor 700(700–710 nm)、Cy7、Alexa Fluor 750 或 H7(780-790 nm) 均为常规串联染料中常用的“受体”染料。

但是，恐怖的是，法国圣艾蒂安大学医院免疫学实验室的Claude Lambert等人发现，在以下方案中，出现了一些意料之外的情况：

• CD3ε Pacific Blue (cloneUCHT1)
• CD4 APC-Alexa 750 (clone13B8.2)
• CD8 Krome Orange (clone B9.11),
• Vbeta 7.1 PE (clone BL37.2)
• Vbeta 17 FITC (clone E17.5F3.15.13)

从下图可见，B图中Vβ7.1 FITC和CD8 Krome Orange之间本不该存在荧光渗漏，但在图上明显看到发生了荧光渗漏，CD4+ Vβ7.1+的群体，出现了不该有的弱表达CD8 Krome Orange信号，为何认为这群不应该，大家从H图可见，去掉Vβ7.1 FITC之后，这群信号就没有了，CD4++CD8+细胞比例从2.93％降到了1.49％，而如果只去掉CD8  Krome Orange，这群信号仍在。这就确认了FITC与Krome Orange（即V510通道）确实存在荧光渗漏，那么这个渗漏的根本原因是什么？当作者把CD3 PB换成CD3 APC-AF750（E图），发现V7.1 FITC向CD8 Krome Orange的荧光渗漏消失了（F图。  这样一套验证流程下来，说明了什么？说明FITC与PB之间发生的FRET，导致了Krome Orange通道（即V510通道）出现了不该有的荧光渗漏信号。  那么是不是TCR Vβ7.1 FITC的个别现象呢？不是，因为作者换了TCRγδ FITC，依然存在这种明显的荧光渗漏，说明就是FITC染料与PB染料之间的FRET，Alexa Fluor488染料和PB染料之间，也会发生FRET。


此外，作者还发现，PE和V610/20染料之间，也会发生FRET效应。

这是首篇报道多色流式实验中不同染料发生FRET效应的文献，这种效应，值得大家在设计多色方案时关注。

参考文献：Waeckel L, et al. FRET causing misleading signal from fluorescein excited by the violet laser in flow cytometry [published online ahead of print, 2023 Aug 8]. Cytometry A. 2023;10.1002/cyto.a.24780. doi:10.1002/cyto.a.24780（影响因子: 3.7，Q2）