Annexin V-PI法检测凋亡

niwanmao · 发表于 2011-12-8 13:34:12

haven_t 发表于 2011-12-8 12:37

登录/注册后可看大图

个人认为空白是必须的，PI与AV并非抗体，所以没有同型对照的说法，另外假设有极端的情况100%细胞都是双阳性 ...

我觉得：
1、没见过这种极端，做实验时组别的设置肯定是从低浓度到高浓度，不可能只用一个高浓度。总会有一个浓度会有正常细胞，至少我做到现在没看到过这么极端的事情。

2、假设你的药物在一个低浓度就使所有细胞全部凋亡，没有一个正常细胞，那么这个药物也就没办法用在临床了，毒性太大。

niwanmao · 发表于 2011-12-8 13:34:45

jingweis530 发表于 2011-12-8 12:59

登录/注册后可看大图

同意，尤其是阴阳分不开的时候。还有做AV-PI法时，AV要调很高的补偿，不知同道们有否这样的情况? ...

我个人认为：如果阳性、阴性分不开，只能说明试剂不好或者细胞有问题。

haven_t · 发表于 2011-12-8 14:55:45

niwanmao 发表于 2011-12-8 13:34

登录/注册后可看大图

1、没见过这种极端，做实验时组别的设置肯定是从低浓度到高浓度，不可能只用一个高浓度。总会有一个浓度 ...

实验是很难说的，如果有前人做过你可以参照别人的浓度，如果你对此完全没有概念的话就只能自己摸索。
当然也有可能细胞培养得不好，就算没有处理就已经死了一大片。
我也做过某些质量不好的标本本底比较高，分群确实不是太明显。
确实以上情况发生的机会很少，但是作为一个好的实验设计，应尽量减少对其他结果的依附，应考虑到一些特殊的情况的发生，所以说明书上也是建议做空白管的。
其实做一个空白管的代价也不大，就是几毫升缓冲液而已，除非细胞特别少，否则我还是建议做一个。

jingweis530 · 发表于 2011-12-9 09:43:00

我也觉得应该做空白管，尤其仪器没有调好，分群又不明显时，当一上测定管时，出现细胞群上移或右移，都搞不清楚究竟是细胞本身的表达情况还是仪器是否调好。
我的做法是：先用空白管调好仪器，再上测定管，如果分群不明显的话，在FSC/SSC 图上先gate活性好的细胞，定好十字线，然后再重新把其他细胞gate起来。就是不明白为什么细胞总向右移，还有补偿会调到很高。

niwanmao · 发表于 2011-12-9 10:14:24

jingweis530 发表于 2011-12-9 09:43

登录/注册后可看大图

我也觉得应该做空白管，尤其仪器没有调好，分群又不明显时，当一上测定管时，出现细胞群上移或右移，都搞不 ...

空白管其实作用就是让你大致知道正常细胞的位置，但不能靠他定MARKER。因为空白管不包含一些背景荧光水平，所以当然会比测定管的正常细胞荧光弱，也就是你所说的测定管的细胞右移。

通常其它标记检测中所用的同型对照就是为了排除背景荧光的干扰，而不是用空白对照，就是这个原因，理解了吗？

haven_t · 发表于 2011-12-9 11:57:50

niwanmao 发表于 2011-12-9 10:14

登录/注册后可看大图

空白管其实作用就是让你大致知道正常细胞的位置，但不能靠他定MARKER。因为空白管不包含一些背景荧光水平 ...

我不知道我的理解是否正确，我所理解的背景分两部分，一部份是细胞自身的荧光，也是我们空白的水平，产生这些信号的原因有很多，免疫学检验里面提到细胞某些代谢产物会有自发荧光，此外细胞的颗粒和药物也可能影响自发荧光水平。就像粒细胞的自发荧光就高于淋巴细胞，在实验中可能还存在某些细胞的自发荧光比淋巴细胞高一个数量级；另一部份是抗体非特异结合的荧光，这类背景是因为荧光抗体与细胞非特异性结合，原因也很多，例如细胞表面的高亲和力Fc受体等原因都会造成。
空白对照对应的是第一部分的背景，同型对照是包含两部分的背景。
所以个人认为同型对照优于空白对照，空白对照优于不设对照。
在相当一部份临床标本中因为非特异结合的水平较低，同型对照和空白对照水平基本相当，基于成本考虑可能就作空白对照就算了。当然也有人不设对照，把阴性群体作为同型对照，其实相当于化学分析的内参，但前提是保证阴性群体能被正确识别。
AV-PI都没有同型抗体，所以经验不足或分析有困难时做个空白保险点保险，但关键还是看个人习惯，结果有可比性就可以了，不存在绝对正确的做法。

niwanmao · 发表于 2011-12-9 12:30:32

haven_t 发表于 2011-12-9 11:57

登录/注册后可看大图

我不知道我的理解是否正确，我所理解的背景分两部分，一部份是细胞自身的荧光，也是我们空白的水平，产生 ...

嗯，应该你所说的这两种都是影响背景的因素。

vetzcm · 发表于 2012-3-26 23:17:26

你说的这个现象，我们在检测时也出现了，也挺苦恼的呵呵我现在都做个空白对照定位十字线的而且未加药物处理组的检测值一直挺高的特别是Q2象限的，不只是细胞生长的问题，还是操作处理细胞引入的假阳性啊 HepG2细胞真的不好做实验啊....

niwanmao · 发表于 2012-3-27 10:03:53

vetzcm 发表于 2012-3-26 23:17

登录/注册后可看大图

你说的这个现象，我们在检测时也出现了，也挺苦恼的呵呵我现在都做个空白对照定位十字线的而且未加药物 ...

贴壁细胞的话，我觉得消化的时候其实对细胞造成了损伤，整体上对细胞物理性状也产生了改变，更加容易影响到检测的。

蓝白小熊 · 发表于 2012-4-2 11:00:32

jingweis530 发表于 2011-12-8 12:59

登录/注册后可看大图

同意，尤其是阴阳分不开的时候。还有做AV-PI法时，AV要调很高的补偿，不知同道们有否这样的情况? ...

可能与染色不完全有关，适当降低细胞浓度或增加染料浓度

账号		自动登录	找回密码
密码			加入流式中文网

[凋亡检测] Annexin V-PI法检测凋亡

评分