流式抗体也可以用于磁珠分选

niwanmao · 发表于 2012-5-12 21:15:38

samly0 发表于 2012-5-12 21:09

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先阴选CD4+T细胞，再阳选CD25-PE标记的细胞，得到的CD4+CD25+标记的细胞，这群细胞绝大部分也是Foxp3阳性的 ...

如果能分享当然好

嗯，看来磁珠的缺点就是不能同时分选多个标记。那么磁珠能不能分选胞内或核内标记呢？

samly0 · 发表于 2012-5-12 21:28:48

磁珠抗体分选获得CD4⁺CD25⁺T细胞方法：
取1×10⁷个细胞量，用含0.5% BSA，2mM EDTA的PBS(buffer液)重悬，加入适量的生物素标记的鸡尾酒抗体(Biotin-Antibody Cocktail)，混匀，4℃避光孵育10min，再加入适量抗生物标记的磁珠(Anti-Biotin MicroBeads)和CD25-PE抗体，混匀，4℃避光孵育15 min，用buffer洗涤后1000 rpm离心10 min，弃上清液，沉淀用500 μl buffer重悬，置LD分离柱于MidiMACS分选器中，l ml缓冲液冲洗LD分离柱2次后，将细胞悬液加入分离柱中，收获从分选柱中流出的细胞即为CD4+T细胞。将收集到的CD4+ T细胞混悬液1000 rpm离心10 min，弃上清液，沉淀用buffer重悬后加入适量的抗CD25-PE磁珠，混匀，4℃避光孵育15 min，用buffer洗涤后1000 rpm离心10 min，弃上清液，沉淀用500 μl buffer重悬，置MS分离柱于MidiMACS分选器中，l ml缓冲液冲洗MS分离柱2次后，将细胞悬液加入分离柱中过柱，再用buffer过柱直至流出液清亮不含细胞，将柱子移离分选器后，收集柱中细胞即为CD4⁺CD25⁺ T细胞
这是我3年前做的方法，现在不知道是不是有新的能分选更多标记的产品和方法了，仅供参考，磁珠分选过程还是很繁琐的，而且比较受限制，如果想同时用3个以上的标记来分选的话，磁珠就不适用了，我个人觉得能用流式分选就不用磁珠分选，呵呵

samly0 · 发表于 2012-5-12 21:33:48

磁珠能不能分选胞内或核内标记我就不太清楚了，可能要问美天妮的技术支持了，磁珠是连在荧光抗体上的，我觉得磁珠还是有体积的，不知道有什么破膜剂可以让胞膜通透性大到可以让磁珠进入胞内？

niwanmao · 发表于 2012-5-12 22:25:08

samly0 发表于 2012-5-12 21:33

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磁珠能不能分选胞内或核内标记我就不太清楚了，可能要问美天妮的技术支持了，磁珠是连在荧光抗体上的，我觉 ...

讨论着，突然发现我们的讨论偏离了主题，呵呵。请SAMLY0有空开个专帖，在“流式杂谈”版块或者这个版块，谈谈自己以前做磁珠分选的心得、经验等等。

samly0 · 发表于 2012-5-12 22:41:17

呵呵，我还是个流式入门者，只是觉得在分享别人宝贵的经验时也应该说说自己的心得，可能其中还包括一些我自己不知道的错误理解，也希望在这里得到经验丰富的同行和老师们的指正

niwanmao · 发表于 2012-5-12 23:08:53

samly0 发表于 2012-5-12 22:41

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呵呵，我还是个流式入门者，只是觉得在分享别人宝贵的经验时也应该说说自己的心得，可能其中还包括一些我自 ...

流式中文网既需要各位无私奉献的版主，也非常需要像您这样热心的站友，入门早晚不是问题，关键是大家能够踊跃地参与到讨论中来，让话题能够慢慢延伸开，最后讨论的人都能得到自己想得到的，或者有时候会发现一些意外收获呢：）

真心地欢迎您以后多多来分享您的经验，帮助其它站友

samly0 · 发表于 2012-5-12 23:15:52

谢谢倪老师，我会努力的，希望以后有机会能到您那边学习进修

niwanmao · 发表于 2012-5-13 00:10:51

samly0 发表于 2012-5-12 23:15

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谢谢倪老师，我会努力的，希望以后有机会能到您那边学习进修

进修谈不上，有些方面我经验也不足。大家互相交流

olivezhou0716 · 发表于 2012-5-25 16:29:03

说两个问题。
1.关于保质期。磁珠保质期一般在6个月左右，产品不同，也会有些差异，去掉公司质检和过海关的过程，一般到用户手上也就4个月的时间，所以我们建议客户实验前把所有的抗体/试剂等都准备好，不要出现因为一种试剂没到影响到整个实验的情况。但是像samly0说的，很多客户用过期的磁珠，甚至是过期2年也不影响结果。提醒大家保存的时候在4度冰箱，这样磁珠的效果会比较好。
1.关于Tregs分选。美天旎现在的产品很丰富，在免疫学领域很多细胞都有可选择的产品。像Treg这样的细胞没有特异性的标记，美天旎就研发了很多试剂盒，通过去除或多重选择的方式得到目的细胞。而且同种细胞还可能有不同的试剂盒，根据自己的实验目的选择，使实验结果最优化。比如Tregs分选的kit就有4种：常规的CD4CD25双阳性，CD4+CD25+CD127-，CD25CD49d-及初始性Treg分选的kit。大家在购买之前可以先查资料，也可以跟我们联系，选择合适的产品。

qq969385787 · 发表于 2015-6-24 12:16:27

samly0 发表于 2012-5-12 21:28
磁珠抗体分选获得CD4CD25T细胞方法：
取1×10个细胞量，用含0.5% BSA，2mM EDTA的PBS(buffer液)重悬，加入 ...

老师您好，想请教几个问题。
1、这个buffer是自己配的？跟美天旎的MACS Buffer是一样的吗？740元50ml；
2、缓冲液冲洗分离柱时，是用重力作用？还是加压？怎么加压？大概要多长时间？
3、分选细胞时，是重力作用还是加压？
4、取1×107，怎么取？？怎么知道数量？

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