CFSE染细胞的一些问题

zark_00 · 发表于 2012-5-13 12:22:52

本帖最后由 zark_00 于 2012-5-13 12:42 编辑

上图
A 未用CD11b 标记巨噬细胞时

无法区分巨噬细胞，仅能从CFSE直方图中按阴性峰阳性峰划分，得出CFSE+的群体。

B 用已经到了一段时间的鸡红细胞，染色后，腹腔液并用CD11b标记
1 只打PBS进腹腔，刺激出巨噬细胞，对照

该腹腔液中没有鸡红细胞，CD11b较好的标记出了巨噬细胞。
2 打CFSE染色鸡红细胞进腹腔
CD11b CFSE-CRBC 050912.JPG

参考PBS对照，划出巨噬细胞门，向下显示在CD11b vs CFSE图中，双阳群是吞噬的，CD11b+CFSE-群体是未吞噬的。

C 用新到的鸡红细胞染色，腹腔液标记CD11b（新到的鸡红细胞上清阿氏液很清，以前来的鸡红细胞上清阿氏液都发红）
1 只打PBS进腹腔，刺激出巨噬细胞，对照
pbs 051212.JPG

难以理解的结果，只打PBS的，怎么会有CFSE阳性群体，
2 打CFSE染色鸡红细胞进腹腔
CD11b CFSE-CRBC 051212.JPG

电压不变的情况下，双阳群近似100%？晕死

niwanmao · 发表于 2012-5-13 15:54:32

zark_00 发表于 2012-5-13 12:22

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上图
A 未用CD11b 标记巨噬细胞时

其实你的实验结果还是不错的。只是可能比例有些偏高，所以重点是找这个原因。

从你上传的图片看，可能是细胞状态是不是不太好，C图状态还可以，但是为什么出现了CFSE阳性细胞，我在想会不会是该标本刚好在CFSE阳性标本后面上机，是由前面那管阳性细胞带进来的污染？

最后一管（D）的细胞状态肯定不佳，从FSC－SSC图就看的出来，所以，这100％的原因我在猜测：有可能是巨噬细胞状态较差，造成细胞膜通透性增高，游离的CFSE（已被酯酶分解过，发光的）通过这些不完整的细胞膜进入细胞。
最后附上一篇参考文献，我觉得你的结果、步骤都问题不大，关键可能还是保证巨噬细胞提取和培养时的状态。（文献900多KB，请耐心等待流式中文网书籍阅读器加载完毕）：

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samly0 · 发表于 2012-5-13 17:21:57

1、我用CFSE染过小鼠脾脏淋巴细胞，当时是加了两倍体积的20%FBS培养基置37度培养箱孵育10min终止反应的，然后又用20%FBS洗涤了两遍后才铺板培养的，因为发现CFSE对淋巴细胞的活性影响很大，有残留CFSE的话，淋巴细胞很难刺激活化增殖的，所以特别小心的弃除残留的CFSE。我也认为加血清可以终止CFSE的染色，具体原因我也不清楚，我猜想可能是因为，其一，加等体积或2倍体积的含血清培养基本身就稀释了CFSE的浓度，其二，血清对细胞有保护作用，血清里的成分可以跟胞膜脂质分子层结合，改变通透性，阻止CFSE透过胞膜进入胞内吧，其三，血清有很多蛋白成分，会不会有些蛋白可以跟CFSE结合而终止其反应的？
2、你担心鸡红细胞裂解后释放出来的CFSE会重新染上巨噬细胞的话，是不是可以换成用淋巴细胞分离液分离的方法，用ficoll或者Percoll不连续密度梯度沉淀法试试看？或者你做个简单的试验看看：先将鸡红细胞染上CFSE，然后裂解，取裂解后的悬液去染巨噬细胞或者别的细胞上流式看看能不能染上，就知道是不是裂解鸡红细胞后的液体含有能标记巨噬细胞的CFSE了。

niwanmao · 发表于 2012-5-13 18:38:38

samly0 发表于 2012-5-13 17:21

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1、我用CFSE染过小鼠脾脏淋巴细胞，当时是加了两倍体积的20%FBS培养基置37度培养箱孵育10min终止反应的，然 ...

第2点里面提到的简单试验倒是个好办法：

先将鸡红细胞染上CFSE，然后裂解，取裂解后的悬液去染巨噬细胞或者别的细胞上流式看看能不能染上，就知道是不是裂解鸡红细胞后的液体含有能标记巨噬细胞的CFSE了。

不过提到换用淋巴细胞分离液分离我想觉得可能不理想，因为平时做到研究生提取的PBMC时，单核似乎微乎其微，巨噬细胞虽是从单核细胞进入组织中分化而来，但体积应该比单核较大，可能更容易丢失。供参考。

samly0 · 发表于 2012-5-13 22:16:42

PBMC里的单核本来就少，所以用淋巴细胞分离液不理想，打过肉汤的小鼠腹腔巨噬细胞应该很多的，总之，我意思就是换一种不需要裂解红细胞的方法试试，目的只是想弄清裂解的鸡红细胞是不是会释放CFSE并标记别的细胞，可以直接用淋巴细胞来代替巨噬细胞观察这个结果的，我也很期待结果，呵呵

samly0 · 发表于 2012-5-13 22:33:18

倪老师附上的文献里好像是将鸡红细胞和巨噬细胞体外共孵育培养的，检测时轻轻弃掉上清就可以去掉悬浮的鸡红细胞了，剩下贴壁的巨噬细胞就可以直接取来检测了，楼主做的应该是体内实验的吧，所以分开腹腔液中的鸡红细胞和巨噬细胞有点难，楼主如果只想看腹腔巨噬细胞的吞噬能力的话，也换成跟文献一样的体外实验方法做做，呵呵

niwanmao · 发表于 2012-5-14 09:53:13

samly0 发表于 2012-5-13 22:16

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PBMC里的单核本来就少，所以用淋巴细胞分离液不理想，打过肉汤的小鼠腹腔巨噬细胞应该很多的，总之，我意思 ...

了解。
的确，我觉得zark是可以按照你前面回帖中提到的最后那种验证方法，排除一下裂解后的鸡红细胞对巨噬细胞是否有影响

niwanmao · 发表于 2012-5-14 09:53:52

samly0 发表于 2012-5-13 22:33

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倪老师附上的文献里好像是将鸡红细胞和巨噬细胞体外共孵育培养的，检测时轻轻弃掉上清就可以去掉悬浮的鸡红 ...

那可能还是体内吞噬更准确一点吧，体内环境更好：）

zark_00 · 发表于 2012-5-14 11:32:11

今天很忙，晚上再发图，结果是染好CRBC中止后洗三次游离CFSE还有残留，而且裂解后也有游离CFSE释放。

samly0 · 发表于 2012-5-14 20:20:40

裂解后释放的CFSE还能重新染上巨噬细胞么？

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