人外周血Th17检测

63735523 · 发表于 2012-11-12 19:58:00

刚买了sigma的莫能霉素，用来做Th17的刺激实验，但是莫能霉素是500mg的，这么大的量，怎么配置啊，要用多少DMSO区溶解啊，我要的工作浓度是10ug/ml。请问有谁做过，指点一下，刚买来，还不敢配

niwanmao · 发表于 2012-11-12 22:01:38

按说明书，莫能霉素可以先用dmso配成50mg/ml的储存液，分多管保存在-20℃。用的时候拿出一只稀释

63735523 · 发表于 2012-11-17 19:54:59

本人没有将所有的莫能霉素溶解，是将15ml离心管在天平上置零，然后在台内，取适量的莫能霉素粉末，再在天平上得出读数，如37mg。再加适量的DMSO溶解，使其浓度为贮存浓度，分装保存，可取一管稀释为工作浓度。这样既保证无菌，又可以节约莫能霉素和DMSO。

63735523 · 发表于 2012-11-29 23:58:20

做了好久的TH17，可就是做不出来。IL-17a的数量几乎没有，可能是刺激的原因。但是我刺激的浓度已经很高了啊，PMA：200ng/ml
离子霉素：1ug/ml。莫能霉素：10ug/ml。刺激4小时，怎么就做不出来呢

63735523 · 发表于 2012-11-30 00:01:47

是人的外周血提的单个核细胞，肝素抗凝的。刺激物是sigma的。用CD3+CD8-IL17A标记的。求高人指点

niwanmao · 发表于 2012-11-30 09:20:07

63735523 发表于 2012-11-30 00:01

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是人的外周血提的单个核细胞，肝素抗凝的。刺激物是sigma的。用CD3+CD8-IL17A标记的。求高人指点 ...

CD3+CD8-细胞比例高吗？

63735523 · 发表于 2012-11-30 09:36:06

CD3+CD8-细胞倒还好。这个有什么关系么

niwanmao · 发表于 2012-11-30 11:37:06

63735523 发表于 2012-11-30 09:36

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CD3+CD8-细胞倒还好。这个有什么关系么

担心你的细胞不纯，如果比例还高的话，说明提取的效果应该不错的。
一般实验刚开始的摸索条件是最艰难的，别急，慢慢找原因，我个人觉得应该要排除以下因素：
1、刺激时间，如果细胞状态还不错，是否可以延长到6小时或更长时间？
2、抗体质量是否有问题？
3、染色的破膜剂是否有问题？
4、刺激是否有效？考虑用CD69来做个质控：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1445-1-1.html

63735523 · 发表于 2012-11-30 13:13:12

我做了质控，大概是百分之80的活化，似乎不够吧？刺激时间我也做了梯度，发现4小时和6小时没有差别。抗体是BD的，破膜剂是联科的。细胞不纯是可能的，但是我怎么做能更纯呢？谢谢老师

63735523 · 发表于 2012-11-30 14:53:06

细胞固定破暯以后，计数板计数还能看到成形细胞么？

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