抗体的滴定方法（推荐，非常重要）

刘星宇

以下的结果图分群也不明显吧？

刘星宇

刘星宇 发表于 2013-1-14 21:56

                               
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查到国内文献，巨噬细胞BLT2表达的流式结果，我感觉也是分群不明显，我们做的是BLT1（另一亚群）在中性粒细胞表面上的表达，我们理解是是BLT1在中性粒上都有表达，但因为强弱不同，有的一个细胞有10个结合位点，有的只有1个结合位点，所以造成分群不明显。
最近一次流式，分别加5μl、2.5μl、1.0μl抗体，结果是5μl组全右移（阳性），而2.5μl、1.0μl组往左缩退，处于“门”的中间，检测老师觉得可能是抗体的问题。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-1-14 22:13

                               
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查到国内文献，巨噬细胞BLT2表达的流式结果，我感觉也是分群不明显，我们做的是BLT1（另一亚群）在中性粒 ...

如果这个抗原确实如你所述，那么应该属于连续表达，英文叫variant，那么应该是分群不清的，这个时候，同型对照或者FMO对照对于设门就非常关键。

renping_jsnj

想问一下楼主，是否需要gate出BLT1 or 2 positive的细胞进行进一步的分析。如果不需要，只是比较一下表达水平有无变化，那对于分群不清的情况不如简单比比geo mean的变化好了。

刘星宇

非常感谢倪老师和renping_jsnj老师。
做了同型对照的，我从论坛上找到的FMO对照内容看得不是很明白（http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=534），要跟检测老师说一下。另外我们暂不需要对圈出的细胞再进一步分析，我们下次看看Geomean参数的结果。

刘星宇

“抗体滴定并不是以抗体量/多少细胞来表示的，要滴定的只是抗体浓度（如ug/ml）。而细胞量是相关性不大的。在标记10万和100万个细胞时，其滴定结果是一样的。”

最近和老师及同门争论这个问题，他们觉得抗体量应该以细胞多少去恒定，表面理解应该是这样，比如同样外加药物刺激100μl中1X10⁵个细胞与1X10⁶个细胞，如果关注每个细胞的药量，则后者所加药剂量应该是前者的10倍。
理不辨不清，说多了，他们都说我钻牛角尖，也许我真的理解错了。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-6-4 18:59

                               
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“抗体滴定并不是以抗体量/多少细胞来表示的，要滴定的只是抗体浓度（如ug/ml）。而细胞量是相关性不大的。 ...

抗体结合动力跟体积相关更大，但是，也不是说细胞总量绝对不管，所以你可以这么表述，估计他们更容易理解：细胞数量控制在10E6以内，此时，进行抗体滴定，找出最佳染色体积。

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-6-4 19:44

                               
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抗体结合动力跟体积相关更大，但是，也不是说细胞总量绝对不管，所以你可以这么表述，估计他们更容易理解 ...

感谢倪老师！也不滴定了，他们认为没有必要，我也不知道有多大必要，就按说明书怎么做就怎么做，我剩下实验时间只有不到两个月，折腾不起了，换了好几个地方做流式，现在回到一台Beckman coulter XL机子做，实验室老师也是不会用。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-6-4 21:54

                               
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感谢倪老师！也不滴定了，他们认为没有必要，我也不知道有多大必要，就按说明书怎么做就怎么做，我剩下实 ...

那么你就说明书抗体量加上100微升标本吧-_-||

lin850424

很多BD抗体是按tests算的，没写浓度，那我应该怎么滴定，从他建议的的vol.作为初始体积开始滴定吗？