PBMC CD8 CD25染不上，染了几个月了一直染不好，都快崩溃了...

mcdfish

niwanmao 发表于 2015-1-28 08:34
1、CellQuest是可以在每个通道那里输入抗体名称的，建议以后获取时把抗体名称也写进去，方便自己或其它人 ...

倪老师，您好！附件是我最近测得CD4/CD8, 这几次都可以染上了。但是这个结果我感觉牛的个体变化太大了。您能帮我分析分析吗？
CD4-FITC；CD8-647.  1-3分别是空白，CD4单染，CD8单染。7-12是我的样品，3个一组。个体差异太大了。我测的是牛的PBMC。

另外，由于我不会用流式细胞仪，所以都是让别人帮我测的。他们很少把颜色和抗体都标出来，但是因为是求别人帮忙的，所以我一般说一下别人不想帮填上去就作罢了。

https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzgxMHxiYjk3ZWFmOHwxNzQxNzc4MjIwfDB8

niwanmao

mcdfish 发表于 2015-4-4 14:49
倪老师，您好！附件是我最近测得CD4/CD8, 这几次都可以染上了。但是这个结果我感觉牛的个体变化太大了。您 ...

你说“3个一组”是指7、8、9三个是同一个标本？10、11、12是同一个标本？
每一管获取的细胞总数太少了，并且CD4荧光太弱，是不是抗体没滴定过？

mcdfish

是的，4/5/6一组，7/8/9一组，10/11/12一组。你说获取的细胞总数少，20000个应该不少吧？。说明书说cd4抗体应该加10ul每管，我怕不够用，用了4ul。我一直觉得有抗体就ok了。没有滴定。

mcdfish

niwanmao 发表于 2015-4-4 21:14
你说“3个一组”是指7、8、9三个是同一个标本？10、11、12是同一个标本？
每一管获取的细胞总数太少了，并 ...

另外我想问下CD4和CD8 一般是什么样的一种规律？

niwanmao

mcdfish 发表于 2015-4-5 11:37
是的，4/5/6一组，7/8/9一组，10/11/12一组。你说获取的细胞总数少，20000个应该不少吧？。说明书说cd4抗体 ...

1、抗体量不是随便可以减的，需要滴定，否则你的结果就是不正确的。
2、你所指的2万个估计是包括死细胞和碎片，那种都是无效信号，你真正获取的淋巴细胞从图中看只有几千个，这也是容易造成误差的原因之一。
3、CD4、CD8不是说有什么样的表达规律，而是这两个标记对于淋巴细胞来说是表达比较高的两个标记，应该是容易测的，所以建议你抗体还是需要滴定，如果不滴定，就用全量进行染色。

zhang4083

这个需不需要刺激呀。

mcdfish

niwanmao 发表于 2015-4-5 13:51
1、抗体量不是随便可以减的，需要滴定，否则你的结果就是不正确的。
2、你所指的2万个估计是包括死细胞和 ...

那怎么才能增加我的细胞量呢？一般不是只能设置总细胞吗？他们说一般是设定20000个。我准备做个滴定试试。

mcdfish

zhang4083 发表于 2015-4-6 14:39
这个需不需要刺激呀。

体外用原菌蛋白刺激了的

niwanmao

mcdfish 发表于 2015-4-6 18:57
那怎么才能增加我的细胞量呢？一般不是只能设置总细胞吗？他们说一般是设定20000个。我准备做个滴定试试。 ...

一般流式细胞仪获取时都可以设置门内的细胞数量。

mcdfish

貌似我们这个只能设total events。好吧，我明天问一下那个老师试试看能不能设。如果不能设的话是不是把total events设得再多一点？