人外周血T细胞亚型分析

西伯男

niwanmao 发表于 2016-8-31 18:00
Th17:CD3-FITC +胞内CD4 PE+ 胞内IL-17-Alex647
Treg: CD3-FITC +胞内CD4 PE+CD25-APC+Foxp3-Alex647
Th ...

倪老师，为什么要染胞内的CD4，我以前做的时候都是染得表面CD4，这样做有什么区别吗？

niwanmao

西伯男 发表于 2016-9-2 09:47
倪老师，为什么要染胞内的CD4，我以前做的时候都是染得表面CD4，这样做有什么区别吗？ ...

是因为楼上要PMA刺激，担心到时候分不清，所以建议染胞内。如果分得清就不用染胞内。

小憨

如果担心CD4内吞的话可以先标记CD4再刺激。配色可以将IFN、IL-4和IL-17标记在同一个样品里，这样可以直接显示他们之间的比例，也许有既分泌IFN和IL-17的细胞，分开染色就不能反应出这一部分的信息了

niwanmao

小憨 发表于 2016-9-2 14:33
如果担心CD4内吞的话可以先标记CD4再刺激。配色可以将IFN、IL-4和IL-17标记在同一个样品里，这样可以直接显 ...

这都行？标记后再刺激这么长时间，荧光不会衰退？

小憨

niwanmao 发表于 2016-9-2 15:42
这都行？标记后再刺激这么长时间，荧光不会衰退？

我用fitc磁珠做过磁珠分选，一周后荧光都还有呢。但是如果是串联染料，我觉得还是慎重点儿。

niwanmao

小憨 发表于 2016-9-3 00:48
我用fitc磁珠做过磁珠分选，一周后荧光都还有呢。但是如果是串联染料，我觉得还是慎重点儿。 ...

嗯，这是一个原因，另一个原因是不是你用的这个抗体表达量比较高，所以即使衰减了还是有足够的强度？

hbezyr

niwanmao 发表于 2016-9-2 15:42
这都行？标记后再刺激这么长时间，荧光不会衰退？

标记CD107a时，就是要求在加刺激前，要把抗体加进来。

niwanmao

hbezyr 发表于 2016-9-5 12:36
标记CD107a时，就是要求在加刺激前，要把抗体加进来。

嗯，还真是，感谢分享。真的是学无止境。
例如下面这篇文章：
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTA2MDF8YWY3MzViYzJ8MTczNTEzMjI4M3wwfA%3D%3D


里面用的CD107a是PC5的，串联染料，这么做也能检测出很好的分群，看来抗体过夜在很多情况下并没有我们想象中的那么脆弱。@小憨

小憨

niwanmao 发表于 2016-9-5 14:14
嗯，还真是，感谢分享。真的是学无止境。
例如下面这篇文章：

但是我觉得对于串联燃料还是要慎重。我听过技术人员的介绍，像PE-Cy5或Cy7这种染料在阳光下曝晒2 h后PE和Cy分子断裂就很强了；所以不但会产生PE-Cy5的信号减弱，关键是会有PE的假阳性，我觉得这两种结果加一起会造成检测结果的严重失真，所以在设计流式实验的时候还是尽量规避串联燃料的长时间标记。当然，一般像PE-Cy5/7这种染料也没那么娇弱，只要能保持低温避光还是可以保存一段时间的；而且现在有的串联燃料如Alex Flour系列稳定性也在不断增加，也为我们流式、免疫荧光等实验提供了方便。

niwanmao

小憨 发表于 2016-9-5 15:34
但是我觉得对于串联燃料还是要慎重。我听过技术人员的介绍，像PE-Cy5或Cy7这种染料在阳光下曝晒2 h后PE和 ...

串联染料光照确实影响大，这是勿庸质疑的，温度还好。只要保证避光，我觉得不需要担心太多。