流式细胞学检测大鼠血液CD45 CD61 白细胞不分群 CD45表达很...

小嗳嗷

niwanmao 发表于 2018-7-18 14:59
裂解不完全不是影响CD45表达，而是因为CD45阴性的红细胞过量，使得CD45＋的白细胞信号被覆盖。
例如我裂 ...

谢谢老师 懂得老师的意思了 还想请问一下老师 全血加入裂解液混匀后达到什么效果才算是裂解好呢？都说是清澈透明。我的标本裂解后是一种红色透明的状态，但离心后的沉淀是红色的。重新加入PBS混匀后呈现微微的黄色（很轻微 用白色背景比对才会看得出来）。
1.这里的清澈透明是指没有颜色且透明的意思吗，满意的裂解状态应该是什么样的呢？是裂解后溶液无色透明 且离心后沉淀也无色？
2.说明书建议100ul全血加入2ml裂解液室温下裂解10-15min，我取了50ul全血，因为担心大鼠的细胞更脆弱，所以才加入了500ul裂解液，室温裂解5min。但老师说我的细胞碎片太多了。。。那增加裂解液用量、增加裂解时间是不是可行的办法？或者说 可以2次裂解吗？我就是有些担心对白细胞和血小板造成影响。
3.老师对我的标本制作流程（全血染色-裂解-洗涤-固定重悬）有没有什么建议？有一些文献是先裂解后染色甚至先固定-裂解再染色。我担心先裂解或先固定会对抗体染色造成影响。

niwanmao

小嗳嗷 发表于 2018-7-18 19:18
谢谢老师 懂得老师的意思了 还想请问一下老师 全血加入裂解液混匀后达到什么效果才算是裂解好呢？都说是清 ...

1、裂解完全，就是离心后，几乎没有红色。
2、不能因为担心脆弱而加入少，关键还是裂解液的性能问题。
3、先把裂解做好再说其它的。

小嗳嗷

niwanmao 发表于 2018-7-20 12:14
1、裂解完全，就是离心后，几乎没有红色。
2、不能因为担心脆弱而加入少，关键还是裂解液的性能问题。
3 ...

恩 确实有同学和我说可以裂解2次 或者PBS洗2次。。。
我还是先把重点关注在裂解上吧。因为离心后确实是有红色沉淀。
还有一个问题请教老师。
全血+抗体孵育后裂解  和全血裂解、少量PBS悬浮后再加抗体孵育，并没有不同吧？

niwanmao

小嗳嗷 发表于 2018-7-21 20:20
恩 确实有同学和我说可以裂解2次 或者PBS洗2次。。。
我还是先把重点关注在裂解上吧。因为离心后确实是有 ...

效果基本一致

小嗳嗷

niwanmao 发表于 2018-7-23 11:23
效果基本一致

在增加了裂解液用量，洗涤后重悬细胞，标本呈现无色透明状态。但出现了新的问题。测试管抗体加入了PE-CD45 和FITC-CD61 同型对照管抗体加入了PE-CD45和FITC-IgG1 （CD61说明书中提及 Isotype Armenian Hamster IgG）。但同型对照管和测试管表达相当。这可该如何解决。。。

whimsyhui

请问大家，我做的心肌炎小鼠的血液流式，这是cd45的单标管，感觉分的不开，请问是一抗的原因吗？感觉理想的结果应该是明显的两个细胞群吧

niwanmao

whimsyhui 发表于 2019-2-28 21:45
请问大家，我做的心肌炎小鼠的血液流式，这是cd45的单标管，感觉分的不开，请问是一抗的原因吗？感觉理想的 ...

很明显，SSC被切了，然后CD45可能分得也不好，建议进行一下抗体滴定。

whimsyhui

niwanmao 发表于 2019-2-28 22:15
很明显，SSC被切了，然后CD45可能分得也不好，建议进行一下抗体滴定。

老师那这种呢？还是裂红的血液，左边两个是空白管，右边的是cd19的单标，这个单标分群也不明显，而且看起来单标管的两群细胞分界值在10的3次方右边两个小格，在和按照空白管界值都接近10的4次方了，这是为什么啊，界值为什么不一样呢？是空白管圈门不准确造成的吗？还有这个cd19分群不明显是抗体的原因吗？还需要更换抗体还是做一下滴度看看呢？刚刚开始接触流式，问题比较多，还请老师赐教

niwanmao

whimsyhui 发表于 2019-3-1 10:18
老师那这种呢？还是裂红的血液，左边两个是空白管，右边的是cd19的单标，这个单标分群也不明显，而且看起 ...

仪器是什么？
先滴定

whimsyhui

niwanmao 发表于 2019-3-2 15:23
仪器是什么？
先滴定

是贝克曼库尔特的CytoFLEX S
好的 我先滴定下试试看