红细胞染色protocol

我想成大牛

niwanmao 发表于 2018-11-25 18:58
你的意思是这两个抗体都是没有荧光素的，那么实验用的是间标方法？实验温度是4度还是室温？ ...

是间标抗体，我是在室温做的。。。有问题吗？

niwanmao

我想成大牛 发表于 2018-11-26 08:45
是间标抗体，我是在室温做的。。。有问题吗？

不知道做过多少个样本？如果每个都如此，实在说不过去，如果个别如此，我觉得可以在37度条件下试试看。

我想成大牛

niwanmao 发表于 2018-11-26 11:11
不知道做过多少个样本？如果每个都如此，实在说不过去，如果个别如此，我觉得可以在37度条件下试试看。 ...

由于PNH红细胞检测敏感度要求高，所以需要用CD235a（Glycophorin A）设门。首先，我们选择了可结合CD235a所有结构形式的克隆，因为一开始我们用了CD59 FITC检测目标抗原，所以CD235a选择了PE标记。然而，很不幸的是，CD235a PE会造成很明显的凝集，稀释也无法缓解这种现象，将CD235a改为FITC标记、CD59改为PE后，这种现象就消失了。
http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... 7&highlight=PNH

倪老师，这是站里的一篇帖子，我感觉找到了原因，我试过之后再来回复。

niwanmao

我想成大牛 发表于 2019-2-12 17:10
由于PNH红细胞检测敏感度要求高，所以需要用CD235a（Glycophorin A）设门。首先，我们选择了可结合CD235a ...

这样的荧光素是会凝

夏之韵

niwanmao 发表于 2019-2-12 23:26
这样的荧光素是会凝

是PE荧光素造成的凝集吗？最近在做红细胞流式（1）不加CD235a，只是加PE标记的二抗也会有聚集（2）APC-CD235a（克隆号HI264）好像也会有些凝集？

niwanmao

夏之韵 发表于 2021-10-28 17:00
是PE荧光素造成的凝集吗？最近在做红细胞流式（1）不加CD235a，只是加PE标记的二抗也会有聚集（2）APC-CD ...

摇床上摇着试试？
我好像都没碰到过你说的情形。

夏之韵

niwanmao 发表于 2021-10-29 20:02
摇床上摇着试试？
我好像都没碰到过你说的情形。

重复了实验，大概能确认，1:100稀释的红细胞，一抗与红细胞表面抗原结合（生理盐水清洗前后均不聚集），加入IgG-PE二抗和APC-CD235a室温孵育30min（生理盐水清洗前后均能观察到聚集，可吹散，流式图见下）。如果只加入IgG-PE，不加APC-CD235a就不聚集。
所以推测是红细胞上结合比较大的荧光素分子造成的？考虑是不是换成AF系列的染料？
请倪老师指教，是哪里有问题，谢谢！

niwanmao

夏之韵 发表于 2021-10-29 20:24
重复了实验，大概能确认，1:100稀释的红细胞，一抗与红细胞表面抗原结合（生理盐水清洗前后均不聚集），加 ...

只加CD235a APC是否有聚集呢？
另外，上机前，静置的时间长吗？