流式新手，抗体染不上。

mandy

niwanmao 发表于 2019-3-23 10:08
从FSC和SSC看，细胞本身的问题不大。

未刺激的样本，厂家推荐的量对大多数样本没问题，但个别种类样本可 ...

好，谢谢倪老师指点，我再调整一下。

mybiosciences

1.用CD3刺激是错误的，CD3刺激是阳性对照。你用感染的纤维细胞刺激，又同时加上CD3。从免疫学上讲，MHC呈递的抗原是第一信号跟TCR结合（CD3就是模拟此作用），CD28是第二信号。所以，你这样做是错误的。
2.培养细胞做胞内细胞因子最好加上胺基类的排除死细胞的染料
3.PBMC加入之后一共培养了多久，应该至少需要24h
4.CD4用PerCP太弱了，换成PerCP-Cy5.5试试
5.研究缺失的那个蛋白的作用，如果能把这个蛋白表达出来或者能够购买这个蛋白，然后做这个实验，可能更好
个人见解哈

mandy

老师您好：
1.因为前面我也没做过这类型的实验，是参考一篇文章，同样的操作，感染病的的成纤维细胞跟PBMC共培养，有加CD3刺激。所以老师您的意思是我这里可以尝试只用CD28，不用CD3是吗？
2.LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation排除死细胞的染料用这个可以吗？
3.PBMC加到成纤维细胞里面，共培养24h后，加入刺激剂18h，再加蛋白转运抑制剂6h。PBMC加入的时间一共是48h。
4.这个我后面看看调整一下。
5.后期也有这样的想法，

mandy

mybiosciences 发表于 2019-3-24 22:27
1.用CD3刺激是错误的，CD3刺激是阳性对照。你用感染的纤维细胞刺激，又同时加上CD3。从免疫学上讲，MHC呈递 ...

老师您好：
1.因为前面我也没做过这类型的实验，是参考一篇文章，同样的操作，感染病的的成纤维细胞跟PBMC共培养，有加CD3刺激。所以老师您的意思是我这里可以尝试只用CD28，不用CD3是吗？
2.LIVE/DEAD™ Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation排除死细胞的染料用这个可以吗？
3.PBMC加到成纤维细胞里面，共培养24h后，加入刺激剂18h，再加蛋白转运抑制剂6h。PBMC加入的时间一共是48h。
4.这个我后面看看调整一下。
5.后期也有这样的想法，

mybiosciences

请问一下，您用是是感染这种病毒是病人的血做实验吗？

mybiosciences

1.对，不用cd3
2.这类染料有一系列的颜色，可以根据实际情况选择
时间应该够了，如果细胞有免疫记忆的话，应该出阳性结果的

mybiosciences

这个病毒感染成纤维细胞后是出病毒到上清还是留在胞内？如果是前者是不是可以用含病毒的上清（是不是可以超声一下？）培养pbmc，如果是后者是不是可以用细胞裂解液培养pbmc？

mandy

mybiosciences 发表于 2019-3-25 22:57
请问一下，您用是是感染这种病毒是病人的血做实验吗？

病毒是实验室的病毒株，宿主是人。分离PBMC的血液是抽自健康人外周血。

mandy

mybiosciences 发表于 2019-3-25 23:02
这个病毒感染成纤维细胞后是出病毒到上清还是留在胞内？如果是前者是不是可以用含病毒的上清（是不是可以超 ...

因为我想看的是这个病毒表达的某个蛋白对PBMC产生IFNγ的作用。
这个蛋白是病毒感染成纤维细胞后表达在成纤维细胞表面的，也有分泌到胞外的片段
因为这里不能保证是分泌出来的胞外段还是膜蛋白起的作用，所以选择保留细胞和上清，一起跟PBMC共培养。