CFSE检测淋巴细胞增殖CD3内吞问题

南瓜妹妹 · 发表于 2020-5-7 17:55:49

niwanmao 发表于 2020-5-7 17:49
细胞密度为50×10E6/ml时，可用5uM CFSE标记
而细胞密度为1×10E6/ml，需要改用1uM CFSE。 ...

好的，谢谢！

讨人厌第一名 · 发表于 2020-5-19 10:11:08

我也有这个问题用PHA-P刺激后，CD3的信号就会减弱，PHA浓度越大消失的就越多，对照组不加PHA刺激的CD3的信号就很明显

RIVA · 发表于 2020-5-19 10:59:39

南瓜妹妹发表于 2020-5-7 15:08
会是CSFE的问题吗？

确实是感觉CFSE加少了

RIVA · 发表于 2020-5-19 11:00:42

niwanmao 发表于 2020-5-7 17:49
细胞密度为50×10E6/ml时，可用5uM CFSE标记
而细胞密度为1×10E6/ml，需要改用1uM CFSE。 ...

一般CFSE是干粉的，一般用dmso稀释，与用pbs稀释一样么？手里没有DMSO

niwanmao · 发表于 2020-5-19 13:56:07

RIVA 发表于 2020-5-19 11:00
一般CFSE是干粉的，一般用dmso稀释，与用pbs稀释一样么？手里没有DMSO

只要根据终浓度，计算出用量即可。

南瓜妹妹 · 发表于 2020-5-23 09:09:12

niwanmao 发表于 2020-5-6 08:16
CD3不会发生内吞的，只有CD4出现，这是反复证实了。
所以你得从设门上找原因，或者抗体标记上找原因。 ...

后来我又做了一次，用CD3/CD28刺激组CD3就不能明显分群而不是不表达，而未加CD3/CD28刺激的就可以检测到CD3明显分群

niwanmao · 发表于 2020-5-23 09:20:24

南瓜妹妹发表于 2020-5-23 09:09
后来我又做了一次，用CD3/CD28刺激组CD3就不能明显分群而不是不表达，而未加CD3/CD28刺激的就可以检测到C ...

你的具体步骤有吗？

南瓜妹妹 · 发表于 2020-5-23 10:03:55

niwanmao 发表于 2020-5-23 09:20
你的具体步骤有吗？

①提前一天包板：每孔的量为0.2ug CD3单抗+0.2ug CD28单抗，溶解在50ul的PBS里，然后把PBS加到96孔板孔里，未刺激组加PBS 50ul，用封口膜把边缘封好，放4度冰箱过夜。外周血4度放置大概4-6小时左右提PBMC，有红细胞裂红4分钟左右，用PBS洗两次。计数板计数，约2.5*10^6/ml，加1uM的CSFE（0.2ul 5mM 到1ml PBS 细胞悬液中，按照流式中文网上的一个视频里的步骤加的CSFE），充分混匀，避光室温孵育15分钟（biolegend试剂说明书推荐20min），用含10%胎牛血清的完全培养基五倍体积终止，4度，5min；用完全培养基洗2两次，用完全培养基重悬②将96孔板内的液体倒掉，用200ul的PBS洗两次，然后加入完全培养基重悬的CFSE处理过的细胞，200ul/孔。另外做有未包板的作为比较，未包板的每孔加入200ul完全培养基重悬的CFSE处理过的细胞后，加.2ug CD3单抗+0.2ug CD28，37度 5%co2 培养三天后；收集细胞，先染死活，FVS780 1:1000，染色15min，然后用PBS洗一次，孵育CD3抗体 4度30min，洗一次后上机

南瓜妹妹 · 发表于 2020-5-23 10:05:09

niwanmao 发表于 2020-5-23 09:20
你的具体步骤有吗？

倪老师，您帮我看看这个步骤有问题吗？

南瓜妹妹 · 发表于 2020-5-23 10:15:13

讨人厌第一名发表于 2020-5-19 10:11
我也有这个问题用PHA-P刺激后，CD3的信号就会减弱，PHA浓度越大消失的就越多，对照组不加PHA刺激的CD3的信 ...

我用的是CD3/CD28刺激的

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