请问细胞PMA刺激后怎么处理能放置1-2天再测且不影响检测？

niwanmao · 发表于 2011-6-3 14:05:38

samly0 发表于 2011-6-3 09:18

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我做过这个：刺激结束后，先染表面标志，再用固定液固定过夜，置于冰箱4°，第二天洗涤完固定液后加穿膜液 ...

能否描述一下您检测的是什么抗原？

sugarswallow · 发表于 2011-6-17 10:03:31

是的，可以这么做的，我也得出这样的结果！

chujindong · 发表于 2011-6-29 12:52:19

回复 sugarswallow 的帖子

你好，我也在做Th17细胞流式。这是我做的步骤，有什么不合理的地方或者有什么技巧请指教，谢谢。
1.       新鲜肝素抗凝血200微升+10%FBS RPMI 1640培养基 800µL+PMA 3µL+ Ionomycin 1µL+ monensin 0.7µL （6孔板）培养箱中培养4小时
2.       离心，300 x g ，5 minutes，弃上清
3.       室温避光裂红，孵育约10分钟. 离心300g 5分钟，弃上清；PBS重悬，离心300g 5分钟，弃上清
4.       PBS100ul重悬，加表面抗体3µL,室温避光孵育30分钟
5.       PBS重悬，离心300g 5分钟，弃上清，重复一次；
6.       弃去上清，加入FIX/PERM 500ul，室温避光20分钟，离心300 x g  5 minutes，弃上清
7.       加Perm/Wash™ buffer 2ml，室温避光孵育10分钟，离心300 x g  5 minutes，弃上清；
8.       100 µl BD Perm/Wash™ buffer重悬，加胞内抗体3uL，室温避光孵育30分钟；
9.       加Perm/Wash™ buffer 2ml，室温避光孵育10分钟，离心300 x g  5 minutes，弃上清；
10.       500ul PBS重悬
11.       上机
因为我最近才做，所以不敢保证条件稳定。

sugarswallow · 发表于 2011-6-30 09:31:28

不好意思，我是用的ebioscience的公司的穿膜液而且我是用PBMC方法做的，所以步骤有些不一样，你的步骤做出来的结果怎样？因为我曾经用过一次全血法，我的红裂液（国产的）的用了之后对细胞影响很大，所以不知道BD的红裂液是否要好些，但是用了封阻剂（BFA或者monensin 后）红裂液的裂红效果就不是很好了，有文献这么报道的！关键你的系统只要可以工作就可以了！

laoshubang · 发表于 2011-7-26 12:58:22

试过不用加权固定，效果还可以。另外外周血直接4度冰箱过夜第二天拿出来也能测。

yanyile · 发表于 2011-9-7 10:46:50

受教了，最近也在做流式，本来还想i着是否可以过夜放置呢，后来想着固定可能影响细胞表面抗原，所以还是选择直接上机检测

youyoufang · 发表于 2011-9-15 15:06:15

最近遇到了类似的问题。在做Treg、Th1/Th2和Th17。因为标完抗体不能立刻检测，所以每次都是加上固定剂后4°放置3天再上机（有机器的老师实验室里面都是这么做的，也没问题），但是我的结果一塌糊涂。只要是这种刺激后标记抗体的项目，结果都没有检测到目的细胞。而未经过刺激的如NK细胞、CD14的检测倒是可以检测到阳性细胞。我就纠结了，究竟是标记完抗体放置时间太长的问题还是刺激剂的问题。希望楼主能详细讲一下Th17的操作，万分感谢啊~~！！！

niwanmao · 发表于 2011-9-15 15:11:51

youyoufang 发表于 2011-9-15 15:06

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最近遇到了类似的问题。在做Treg、Th1/Th2和Th17。因为标完抗体不能立刻检测，所以每次都是加上固定剂后4° ...

加固定剂放3天还能测出结果？你为什么不能约好时间，然后大概提早个几个小时进行标记？

到底是刺激剂的问题还是放置时间过长的问题，需要你用新鲜标本验证之后才能得出，新鲜标本没测过，谁都无法证实，但是我可以肯定的是，这3天时间绝对会使一个正常结果变成阴性结果。

youyoufang · 发表于 2011-9-16 11:28:24

niwanmao 发表于 2011-9-15 15:11

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加固定剂放3天还能测出结果？你为什么不能约好时间，然后大概提早个几个小时进行标记？

到底是刺激剂的 ...

嗯：主要是每次采样（病人治疗后）和检测的时间实在是错不开。最近正在协商解决中。
对了，请教您一下关于Th17的事情，周围没人做过。我用的刺激剂是和Th1/Th2一样的时间和浓度不知道行不行？检测的时候一起检测CD3 CD4 CD8，方案可以么？谢谢！！

niwanmao · 发表于 2011-9-16 11:46:55

youyoufang 发表于 2011-9-16 11:28

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嗯：主要是每次采样（病人治疗后）和检测的时间实在是错不开。最近正在协商解决中。
对了，请教您一下关 ...

我只是帮别人检测过，刺激没做过，但相关方案资料本站里面已有：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=716
里面有小鼠和人两种。

一起检测CD3、CD4、CD8当然可以，跟IL17合起一起刚好4色嘛。

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