关于流式抗体滴定

niwanmao

15955413540 发表于 2021-6-19 22:45
老师，我的意思就是如果某一种抗体没有了，考虑到货期问题，能否用与之相同的激发光和发射光的荧光素标记来 ...

例如CD3 APC没有了，用CD3 AF647替代？

15955413540

应该差不多是这个意思

Sarah

niwanmao 发表于 2021-6-13 10:31
主要是选择的样本有关，假如你选择的样本是某个标记全阳的，那么建议混入一些其它阴性的细胞，便于计算信 ...

老师，你好！对不同稀释倍数的抗体，需要保证它们的设门的位置要一致来确保阳性细胞和阴性细胞吗？还是说只要把阴阳性群的核心部分圈出来再计算MFI？

niwanmao

Sarah 发表于 2021-8-3 15:00
老师，你好！对不同稀释倍数的抗体，需要保证它们的设门的位置要一致来确保阳性细胞和阴性细胞吗？还是 ...

只要把阳性和阴性分别圈出，两个群体都尽量能够集中比较好，太散计算不准。

Sarah

niwanmao 发表于 2021-8-3 19:24
只要把阳性和阴性分别圈出，两个群体都尽量能够集中比较好，太散计算不准。 ...

老师，我还是有点疑惑，我的疑惑是：阳性群体会随着稀释度的升高而左移，那这样子的话，我的阳性画门是否需要相应的左移呢？还是说要保持不变

niwanmao

Sarah 发表于 2021-8-4 22:06
老师，我还是有点疑惑，我的疑惑是：阳性群体会随着稀释度的升高而左移，那这样子的话，我的阳性画门是否 ...

需要左移，要圈中群体。

Sarah

niwanmao 发表于 2021-8-5 09:16
需要左移，要圈中群体。

谢谢老师，我已经明白了。我还有几个问题想请教一下：1. S/N的结果与SI的结果不一样，但是SI的结果更可信，是吗？根据计算公式来说，的确是SI更可信，但是为什么还要用S/N的结果判断呢？2. 为什么稀释倍数低的组，阳性群的MFI值反而低？3. 抗体滴定是为了找到最适的抗体使用浓度，但是抗体使用浓度过低时，阴阳性群体可能分开得不是很明显，但是当抗体使用浓度过高时，阴阳性群是能明显分开得，但是对于有一些抗体，它们的SI值为什么会低呢？抗体浓度使用过高，只能说明抗体已达到饱和，剩下的抗体也就是浪费，或者会影响的后续的补偿和结果。但是SI值为什么会低不是很懂？

niwanmao

Sarah 发表于 2021-8-6 23:21
谢谢老师，我已经明白了。我还有几个问题想请教一下：1. S/N的结果与SI的结果不一样，但是SI的结果更可信 ...

1、信噪比=阳性群MFI/阴性群MFI， 染色指数=（阳性群MFI-阴性群MFI）÷（2×SD(阴性群)），由于染色指数将阴性群的标准差（即分布宽度）考虑在内，故是更好的评估指标。 另外，信噪比这条公式，在计算某些电压不足导致阴性群MFI为负数时，会存在问题。
2、抗体浓度和染色指数之间，存在一个逐渐达峰然后再回落的曲线关系，过浓导致的阳性群MFI降低，与免疫学上的hook效应有关。
3、这个问题与第2条相关的，并且染色指数我前面说过了，除数是阴性峰的SD，所以阴性峰的宽度在抗体过量时会由于非特异性结合水平增高而增大，因此除数增大，那么商就降低了。

Sarah

niwanmao 发表于 2021-8-7 10:13
1、信噪比=阳性群MFI/阴性群MFI， 染色指数=（阳性群MFI-阴性群MFI）÷（2×SD(阴性群)），由于染色指数 ...

好的，谢谢老师，还有一个问题：抗体过量，会导致非特异性结合，它是造成阴性群的MFI增大，而不是阳性峰的MFI增大，出现假阳性？另外，阴性群的SD是不是因该是被除数？

Sarah

niwanmao 发表于 2021-8-7 10:13
1、信噪比=阳性群MFI/阴性群MFI， 染色指数=（阳性群MFI-阴性群MFI）÷（2×SD(阴性群)），由于染色指数 ...

老师，你帮我看看，是不是有问题？我用小鼠的脾细胞做抗体滴定，但是1：800 （0.25ug/ml）的稀释居然是最好的，这是不是跟我我的荧光有关，APC是强荧光，所以稀释倍数可以相比其他的抗体要大一下？