关于用PI测定细胞周期的问题

steven

niwanmao 发表于 2021-6-30 21:34
乙醇固定后，-20度保存，定期批量检测即可。

好的谢谢倪老师。

steven

niwanmao 发表于 2021-6-30 21:34
乙醇固定后，-20度保存，定期批量检测即可。

倪老师，我提取了大鼠的PBMC，然后做了一次检测。 FSC/SSC图中明显分出来3群细胞，红色的PI值很低，估计是红细胞（没进行红细胞裂解），绿色的我觉得是PBMC，蓝色的PI值是绿色的2倍，是混进来的其他细胞吗？整体来看10＾3处细胞计数最多，之后几个峰荧光值都是成倍增长的关系。
可以用这个图来确定2N细胞的PI值了吗？还是需要再优化之后才可以。

另外，细胞周期分析时固定剂可以选择4%PFA+TritonX吗，细胞数量少，我怕醇类固定细胞又没了。

Fish形影单只

你的离心机是角转子离心机还是水平离心机？我试过角转子离心机，离心会贴在流式管旁边，倒弃上清的时候会被带走。用水平离心机，可以保证离心在管底。

niwanmao

steven 发表于 2021-7-13 13:55
倪老师，我提取了大鼠的PBMC，然后做了一次检测。FSC/SSC图中明显分出来3群细胞，红色的PI值很低，估计是 ...

粘连体排除排除看。
细胞周期还是得用乙醇的。醛类+Triton相对比较难做。

steven

Fish形影单只 发表于 2021-7-13 14:38
你的离心机是角转子离心机还是水平离心机？我试过角转子离心机，离心会贴在流式管旁边，倒弃上清的时候会被 ...

谢谢你的建议。
我已经换了水平离心机，还是离不下来，可能细胞确实是固定后碎片化了。
大家都说做细胞周期细胞量需要的多，可能就是这个原因，太少的话固定完了都不剩啥了。

steven

niwanmao 发表于 2021-7-13 15:03
粘连体排除排除看。
细胞周期还是得用乙醇的。醛类+Triton相对比较难做。 ...

我昨天做的时候排除了粘连体，只不过对结果没什么影响，就没放在图里。
粘连体大部分就是FSC/SSC中明显出现的3群外的那些散点，还是不知道蓝色的这群是啥。
看这个结果，可以认定绿色群就是2N吗，大家做PBMC内参的时候是PI只有一个峰吗？
昨天我用PFA+TritonX试验了一次，确实效果很不好，PI的图像都连成了一片，区分很不明显。
以后还是老实地用乙醇吧，尽可能多准备点细胞。
另外70%乙醇和甲醇可以互换吗，乙醇好像除了细胞周期分析应用的很少。

家的感觉

steven 发表于 2021-7-14 09:47
我昨天做的时候排除了粘连体，只不过对结果没什么影响，就没放在图里。
粘连体大部分就是FSC/SSC中明显出 ...

粘连的不是用FSC/SSC，应该用PI-A/W/H去排除

steven

家的感觉 发表于 2021-7-14 12:44
粘连的不是用FSC/SSC，应该用PI-A/W/H去排除

谢谢，我的意思是粘连的信号（FSC-A/H区分）显示在FSC/SSC图中就是那些散点，所以分群的这些细胞应该不是粘连体。

niwanmao

steven 发表于 2021-7-14 13:19
谢谢，我的意思是粘连的信号（FSC-A/H区分）显示在FSC/SSC图中就是那些散点，所以分群的这些细胞应该不是 ...

前面@家的感觉  站友说的很清楚了，请按此建议处理。

0忧郁的王子0

有文献说可以分核，可以参照一下？我还没来得及试：
METTL3 Regulates Liver Homeostasis, Hepatocyte Ploidy, and Circadian Rhythm-
Controlled Gene Expression in Mice。
感觉他们的结果很漂亮，试一下？